亮菌口服液對5-FU化療后小鼠腸黏膜屏障及腸道菌群移位的影響

董文欽，朱耀東，李 平，張 梅

化療引起的腸黏膜屏障的損傷，又稱“化療性腸黏膜損傷”(chemotherapy-inducedintestinal mucosal injury, CIMI)，是目前癌癥化療中常見的副作用[1]。目前對CIMI的防治主要集中于控制癥狀，促進腸黏膜修復(fù)等，但許多藥物價格昂貴，效果欠佳[2]。亮菌是我國最早發(fā)現(xiàn)并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一種真菌，經(jīng)發(fā)酵提取的亮菌口服液(armillariella oral solution, AOS)常被用于臨床。研究[3]表明，AOS能夠明顯改善慢性胃炎、腸炎的臨床癥狀和體征。課題組前期研究[4]證實，AOS的主要成分亮菌多糖能緩解CIMI，其機制可能與抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)，然而，CIMI作用機制復(fù)雜，其是否與腸黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)有關(guān)，相關(guān)的研究報道較少。研究[5]表明，腸道菌群失調(diào)是5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)誘導(dǎo)CIMI中重要的作用機制之一，腸黏膜屏障的破壞使不同的病原體進入宿主，導(dǎo)致腸黏膜的損傷[6]。該研究通過建立化療性腸黏膜損傷模型，用AOS進行干預(yù)，檢測不同劑量AOS作用后腸黏膜屏障和菌群移位的情況，探討AOS對化療性腸黏膜損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑C57BL/6小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，雌雄不拘，SPF級，體質(zhì)量(17～22)g，4～6周，共36只。處于室溫22 ℃，濕度50%，通風(fēng)環(huán)境良好。AOS購自合肥誠志生物制藥有限公司；雙歧桿菌三聯(lián)活菌片(combined bifidobacterium and lactobacillus tablets group,CBL )購自內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司；5-FU購自天津金耀有限公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran, FITC-Dextran)購自西安瑞禧生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；麥康凱培養(yǎng)基和哥倫比亞血平板購自合肥天達(dá)診斷試劑有限公司。帶狀閉合蛋白(zonula occludens, ZO-1)小鼠單克隆抗體、咬合蛋白(occludin)小鼠單克隆抗體購自美國Proteintech公司；小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器ThermoFisher FC型全波長多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；AIR TECH型超凈工作臺購自蘇州市蘇凈集團安泰公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PYX-DHS型恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進醫(yī)療器械廠；全自動微生物分析儀(VITEK 2 Compact)購自法國Biomerieux公司；GFL1008型水浴鍋購自深圳市朗誠科技股份有限公司；LG300型光學(xué)顯微鏡購自無錫市朗伽生物醫(yī)學(xué)有限公司；RM2235型切片機購自德國萊克公司；Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件購自美國Media Cybernetics公司。

1.3 實驗分組及處理適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將36只小鼠隨機分均為6組：正常組，模型組,雙岐桿菌組(450 mg/kg)[7]，亮菌口服液低劑量組(1 ml/kg)、中劑量組(5 ml/kg)、高劑量組(10 ml/kg)[8]。模型組、AOS組和雙歧桿菌組均接受5-FU腹腔注射7 d(50 mg/kg，第8～14天)，化療前2 h分別接受等體積生理鹽水、亮菌口服液及雙歧桿菌溶液灌胃，共14 d(第1～14天)。

1.4 檢測

1.4.1小鼠腸組織肉眼觀及光鏡下觀察 化療結(jié)束后24 h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出十二指腸下端至回盲部腸管，觀察腸組織大體形態(tài)。取中段空腸2～3 cm，浸入4%多聚甲醛中，固定24 h。石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腸黏膜結(jié)構(gòu)。

1.4.2FITC-Dextran示蹤法[9]檢測腸道通透性 實驗結(jié)束前4 h動物禁食水，應(yīng)用FITC-Dextran灌胃(40 mg/100 g)，4 h后取血，肝素抗凝，3 500 r/min 離心10 min。取血漿25 μl加入100 μl PBS，用全波長多功能酶標(biāo)儀測定其熒光強度，激發(fā)光波波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品濃度。

1.4.3ELISA檢測血漿內(nèi)毒素含量 取血，肝素抗凝，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血漿，采用ELISA檢測內(nèi)毒素含量，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.4.4腸道細(xì)菌移位檢測 CO2吸入麻醉小鼠后，無菌條件下摘取數(shù)個腸系膜淋巴結(jié)及肝、脾組織，稱取相同重量后無菌生理鹽水沖洗干凈置于無菌組織勻漿器中研磨，加入無菌生理鹽水稀釋成1 ml的勻漿液。取勻漿液100 μl，接種于麥康凱培養(yǎng)基平板，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，并用哥倫比亞血平板進行分離培養(yǎng)，VT2 compact鑒定，后計數(shù)不同組內(nèi)臟器官發(fā)生腸道菌移位情況。凡是組織勻漿中培養(yǎng)出3個或3個以上腸道菌落即為陽性。

1.4.5免疫組化檢測腸組織緊密連接ZO-1、occludin蛋白的表達(dá) 按照免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(streptomyces avidin-peroxidase,SP)操作，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)溶液98 ℃煮10 min抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑溫育10 min，洗滌，滴加一抗(抗ZO-1、occludin抗體稀釋度分別為1 ∶400、1 ∶400)，4 ℃冰箱孵育過夜，加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，37 ℃孵育20 min，洗滌，DAB顯色3 min，復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明，干燥后中性樹膠封片觀察。應(yīng)用Image-Pro-Plus軟件進行圖像分析，分別測定緊密連接ZO-1、occludin蛋白的累積光密度(integrated optical density，IOD)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況及體質(zhì)量變化正常組小鼠飲食、活動正常，受刺激后反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤，體質(zhì)量持續(xù)增加，大便正常。模型組小鼠化療后第5、6天，飲食及活動減少，受刺激后反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量明顯呈下降趨勢，有中度或重度腹瀉癥狀。與模型組比較，AOS中、高劑量組及雙歧桿菌組小鼠體質(zhì)量減少程度降低(P<0.05)，腹瀉程度也減輕，受刺激反應(yīng)和活動尚可；低劑量組與模型組相比，體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠化療前后體質(zhì)量變化

1：正常組；2：模型組；3：AOS低劑量組；4：AOS中劑量組；5：AOS高劑量組；6：雙歧桿菌組；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.2 小鼠腸組織肉眼觀及光鏡觀察化療結(jié)束后24 h處死小鼠，取下整個小腸組織，肉眼觀察不同組小腸大體標(biāo)本的變化。正常組小腸可見其腸管色澤鮮嫩，呈淡黃色，彈性良好，無充血、水腫等表現(xiàn)，而模型組小腸腸管呈黑紅色改變，彈性差，充血水腫明顯；亮菌口服液高劑量組及雙歧桿菌組可見腸管損傷明顯減輕，腸腔輕、中度水腫，無明顯出血，彈性尚可。見圖2。

圖2 各組小鼠腸組織肉眼觀察

圖3 各組小鼠腸組織光鏡觀察 HE×200

HE染色檢測空腸組織病理學(xué)改變。與正常組相比，模型組有嚴(yán)重的組織損傷，包括絨毛的萎縮，變形或者消失，腸隱窩加深，甚至丟失，炎癥細(xì)胞的浸潤，空泡化和水腫(圖3B中a示絨毛的萎縮，水腫，b 大量炎癥細(xì)胞浸潤，c 隱窩結(jié)構(gòu)的丟失)。然而，中劑量組絨毛高度有所恢復(fù)，隱窩變淺，炎癥細(xì)胞浸潤減少，高劑量組絨毛高度恢復(fù)，隱窩排列整齊，各層結(jié)構(gòu)相對清晰完整。由此提示AOS可緩解5-FU誘導(dǎo)的腸黏膜損傷，尤以中、高劑量組效果明顯。另外，雙歧桿菌組腸黏膜的損傷也明顯緩解。見圖3。

2.3 各組小鼠血漿FITC-Dextran濃度及細(xì)菌內(nèi)毒素含量的測定與正常組比較，模型組小鼠血漿中FITC-Dextran的濃度明顯增加，內(nèi)毒素含量也升高(P<0.05)；與模型組比較，AOS組FITC-Dextran濃度及內(nèi)毒素含量下降，且中、高劑量組及雙歧桿菌組下降明顯(P<0.05)，而低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腸黏膜通透性檢測指標(biāo)比較

與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.4 腸道菌群臟器移位率的測定正常組小鼠各臟器并無腸道菌群移位現(xiàn)象，而模型組小鼠內(nèi)臟器官出現(xiàn)較多細(xì)菌移位現(xiàn)象。與模型組比較，給予AOS后，小鼠內(nèi)臟器官腸道菌移位率顯著下降，尤以中、高劑量AOS明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雙歧桿菌組內(nèi)臟器官移位率也明顯下降(P<0.01)。提示AOS緩解腸黏膜炎癥可能與減少小鼠腸道細(xì)菌移位有關(guān)。見表2。

表2 各組小鼠臟器腸道菌群移位情況

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.5 各組小鼠腸組織中ZO-1、occludin蛋白的表達(dá)腸道緊密連接蛋白位于相鄰細(xì)胞頂側(cè)，ZO-1蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)，occludin蛋白位于細(xì)胞膜外，胞質(zhì)內(nèi)也可見分布，免疫組化染色后陽性表達(dá)為棕黃色顆粒沿膜連續(xù)分布。與正常組比較，模型組可見棕黃色顆粒染色變淺、減少，成弱陽性，分布不連續(xù)，緊密連接蛋白表達(dá)明顯減少；與模型組比較，AOS組棕黃色顆粒增多，染色增強，沿膜連續(xù)分布，ZO-1及occludin蛋白的表達(dá)增加。見圖4、圖5。半定量分析IOD值，模型組蛋白表達(dá)明顯低于正常組(P<0.01)；AOS中、高劑量組與模型組比較，蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)。見圖6A、6B。

圖4 各組小鼠腸組織中ZO-1蛋白的表達(dá) 免疫組化×400

圖5 各組小鼠腸組織中occludin蛋白的表達(dá) 免疫組化×400

圖6 各組小鼠腸組織中ZO-1、occludin蛋白的表達(dá)

A：ZO-1蛋白陽性表達(dá)；B：occludin蛋白陽性表達(dá)；1：正常組；2：模型組；3：AOS低劑量組；4：AOS中劑量組；5：AOS高劑量組；6：雙歧桿菌組；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

3 討論

腸黏膜炎是癌癥化療的常見并發(fā)癥和劑量限制性毒副作用,但是到目前為止，仍然缺乏有效的治療策略。越來越多的研究[10]表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥能夠減輕化療相關(guān)副作用。AOS是從一種真菌-亮菌中分離、純化，培養(yǎng)后精制而成的中藥制劑，其主要成分是亮菌甲素和亮菌多糖，具有解痙、消炎、保肝、降酶、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、促進造血功能恢復(fù)等作用[11]。本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上，進一步探討AOS對CIMI的保護作用及可能的作用機制。

化療誘導(dǎo)的腸黏膜炎作用機制涉及眾多環(huán)節(jié)，其中腸黏膜屏障的破壞，導(dǎo)致功能的缺失，從而使有害物質(zhì)侵入，也較為關(guān)鍵。機械屏障是腸黏膜重要屏障之一，主要由黏膜表面的粘液層、腸上皮細(xì)胞及其緊密連接、黏膜下固有層等組成。而腸上皮緊密連接是腸腔和黏膜之間的電荷和分子大小選擇性屏障，在調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的通透性方面起重要作用[12]。其主要由咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、連接黏附分子、帶狀閉合蛋白ZO 家族(ZO-1、ZO-2 和ZO-3)及與其相連的細(xì)胞骨架蛋白等組成[12]。緊密連接蛋白減少、缺失或移位，腸道通透性增加，可引起化療性腸黏膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎，炎癥性腸病[13]等疾病。本研究顯示，給予AOS后，腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)較模型組明顯升高。FITC-Dextran是一種低分子多聚糖，正常情況下，小鼠體內(nèi)不含F(xiàn)ITC-Dextran且不被小腸吸收，經(jīng)胃管進入消化道的FITC-Dextran進入血液循環(huán)的唯一方式便是破壞腸道屏障的完整性。血漿中的熒光強度愈強，F(xiàn)ITC-Dextran的濃度愈高，提示腸黏膜屏障損害越嚴(yán)重。本研究也顯示，AOS干預(yù)后，血漿中FITC-Dextran濃度降低。這些結(jié)果提示，AOS對腸黏膜的機械屏障有保護作用，能降低腸上皮細(xì)胞的通透性，緩解腸黏膜的損傷。

腸黏膜的生物屏障主要由正常的腸道菌群構(gòu)成，正常情況下這些菌群間相互制約，并與宿主之間維持相對穩(wěn)定。化療藥物作用后，腸道菌群與宿主之間的平衡被打破，腸道中的菌群或細(xì)菌代謝產(chǎn)物透過黏膜屏障，轉(zhuǎn)移到腸系膜淋巴結(jié)和腸腔外其他器官或部位，這一過程也稱為細(xì)菌移位[14]。本研究結(jié)果顯示，給予AOS后，血漿中內(nèi)毒素含量及菌群移位率明顯下降，提示AOS明顯改善了化療后小鼠腸道菌群移位的情況。

綜上所述，AOS可能是通過抑制腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)，降低腸道黏膜的通透性，進而抑制細(xì)菌及內(nèi)毒素的移位，緩解化療后損傷的腸黏膜。然而，有研究[15]表明，化療藥作用后腸道內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，是否AOS緩解CIMI也與調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡有關(guān)，需待進一步研究。