丙咪嗪經(jīng)酸性鞘磷脂酶/神經(jīng)酰胺通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活

蔣建軍，楊 進(jìn)，金永梅，操基玉，陸友金

炎癥反應(yīng)是病理情況下的局部保護(hù)過(guò)程，在機(jī)體受到外界刺激時(shí)，炎癥在先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用；然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)通常導(dǎo)致組織損傷和機(jī)能障礙，如敗血癥、炎癥性腸病、牛皮癬等[1-2]。目前臨床上使用的大部分抗炎藥物都存在不容忽視的不良反應(yīng)。因此，探索副作用更小且更加有效的抗炎藥物仍是該領(lǐng)域的迫切任務(wù)。NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3)炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)中主要的細(xì)胞內(nèi)炎性途徑[3]，NLRP3炎癥小體的過(guò)度激活引發(fā)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的過(guò)度釋放，進(jìn)而促進(jìn)過(guò)度的炎癥反應(yīng)在多種炎癥相關(guān)疾病中被證實(shí)[4]。因此，NLRP3炎癥小體可以作為相關(guān)疾病預(yù)防和治療新靶點(diǎn)。

丙咪嗪是臨床上常見的三環(huán)類抗抑郁藥，具有抗炎、抗凋亡等藥理學(xué)作用[5]。已知丙咪嗪可顯著抑制酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASM)的活性，ASM是水解鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺(ceramide, Cer)的調(diào)控關(guān)鍵酶[6]。本課題組前期研究[5]顯示，在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中，使用丙咪嗪可顯著改善小鼠肺部炎癥反應(yīng)，并提高小鼠存活率。然而，丙咪嗪是否通過(guò)對(duì)ASM/Cer通路的調(diào)控進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用，目前仍不清楚。該研究采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞作為體外炎癥模型，從NLRP3炎癥小體途徑研究丙咪嗪對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7由安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2主要藥品與試劑 LPS、丙咪嗪(美國(guó)sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；BI胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK-8細(xì)胞活性測(cè)定試劑(合肥白鯊生物科技有限公司)；抗NLRP3抗體、抗caspase-1抗體、抗IL-1β抗體；抗IL-18抗體、抗ASM抗體(美國(guó)abcam公司)；抗Cer抗體(美國(guó)ENZO公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；VE-180電泳儀、VE-186轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀(上海天能技術(shù)有限公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、炎癥模型的構(gòu)建 小鼠RAW264.7細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%BI胎牛血清和1%抗生素(100 mg/L鏈霉素和100 mg/L青霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于條件為37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將LPS加入至培養(yǎng)液中致LPS的最終濃度為1 mg/L，使細(xì)胞成多角形形態(tài)以及偽足數(shù)量增加，建立成熟的炎癥模型。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將密度為1×108/L的RAW264.7細(xì)胞懸液加入至96孔板，每孔100 μl。設(shè)置空白組(空白組不加細(xì)胞，僅加入100 μl培養(yǎng)液)、對(duì)照組、丙咪嗪組(給藥濃度為20、40、60、80、100 μmol/L)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量各孔的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3Western blot法檢測(cè)ASM、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá) RAW264.7細(xì)胞按分組處理8 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)凝膠電泳法分離后，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h TBS漂洗3次，每次10 min；加入說(shuō)明書中指示的相應(yīng)稀釋濃度的一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜。次日TBST漂洗4次，每次10 min，然后加入二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗4次，每次10 min，ECL法顯影，使用Tanon圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.4ELISA法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18含量 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%左右，隨機(jī)設(shè)置空白對(duì)照組、LPS組(1 mg/L)、LPS+丙咪嗪組(20、40、60 μmol/L丙咪嗪預(yù)先處理RAW264.7細(xì)胞2 h后與1 mg/L LPS共同作用)。培養(yǎng)8 h后吸取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。

1.2.5免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Cer表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞消化離心后，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L。于12孔板中各放入一個(gè)細(xì)胞爬片，取50 μl細(xì)胞懸液均勻抹于爬片上，貼壁2 h后加入1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)液。分別向各孔中加入終濃度為0、1 mg/L LPS、20 μmol/L丙咪嗪+1 mg/L LPS、60 μmol/L丙咪嗪+1 mg/L LPS(丙咪嗪預(yù)先處理RAW264.7細(xì)胞2 h后與1 mg/L LPS共同作用)的培養(yǎng)液1 ml，作用8 h。吸去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%TritonX-100破膜20 min, 0.1%的胎牛血清蛋白(BSA)封閉1 h。吸去封閉液后，加入PBS稀釋的Cer抗體(1 ∶50)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日回收一抗，PBS清洗后加入由PBS稀釋的熒光二抗(1 ∶200)。避光室溫孵育1 h，吸去二抗，PBS清洗，DAPI染核，甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2 結(jié)果

2.1 丙咪嗪對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響丙咪嗪在濃度為0～60 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯毒性，其細(xì)胞活力與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2.2 丙咪嗪對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，LPS明顯增加了細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)(P<0.01)；然而，給予丙咪嗪預(yù)處理可顯著抑制細(xì)胞中NLRP3(F=33.86,P<0.01)、caspase-1(F=96.05,P<0.01)、IL-1β(F=55.74,P<0.01)和IL-18(F=165.42,P<0.01)的蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、3。

2.3 丙咪嗪對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放IL-1β和IL-18的影響與對(duì)照組相比，LPS明顯增加了細(xì)胞上清液中IL-1β(35.43±5.38)和IL-18(63.86±6.54)的含量(P<0.01)；然而，給予丙咪嗪預(yù)處理可顯著抑制細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的釋放，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.52,P<0.01)、(F=42.95,P<0.01)；抑制的程度與其濃度有關(guān)，在丙咪嗪濃度為60 μmol/L時(shí)，IL-1β(17.41±2.51)和IL-18(38.42±3.86)的釋放抑制最明顯，見圖4。

圖2 丙咪嗪對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)的影響

A：Western blot檢測(cè)NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)；B、C：NLRP3、caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.4 丙咪嗪對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中ASM蛋白表達(dá)和Cer含量的影響與對(duì)照組相比，LPS顯著增加了細(xì)胞中ASM的蛋白表達(dá)(P<0.01)；然而，ASM抑制劑丙咪嗪可使其恢復(fù)至正常水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.66,P<0.01)(圖5)。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS顯著增加了細(xì)胞中Cer的含量(P<0.01)；而丙咪嗪可顯著抑制LPS所致Cer改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.16,P<0.01)(圖6)。

圖3 丙咪嗪對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響

A：Western blot檢測(cè)IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)；B、C：IL-1β、IL-18蛋白相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖4 丙咪嗪對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-18釋放量的影響

A：IL-1β；B：IL-18；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖5 丙咪嗪對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中ASM蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖6 丙咪嗪對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中Cer生成的影響 免疫熒光染色×200

A：對(duì)照組；B：LPS組(1 mg/L)；C：LPS(1 mg/L)+丙咪嗪組(20 μmol/L)；D：LPS(1 mg/L)+丙咪嗪組(60 μmol/L)；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

3 討論

本研究結(jié)果表明，丙咪嗪通過(guò)對(duì)ASM/Cer通路的調(diào)控進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用。該研究結(jié)果首次證明了丙咪嗪經(jīng)NLRP3炎癥小體途徑起到抗炎作用，并且進(jìn)一步揭示了ASM/Cer通路在NLRP3炎癥小體激活中的關(guān)鍵作用。

NLRP3炎癥小體在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，大量研究[7]表明，NLRP3炎癥小體的激活與多種炎癥相關(guān)的疾病密切相關(guān)。因此，了解NLRP3炎癥小體激活的分子機(jī)制為炎癥性疾病提供新的診療思路具有重要意義。然而，大量研究[8]表明Cer在不同的病理?xiàng)l件下啟動(dòng)NLRP3炎癥小體的形成和活化，包括胰島素抵抗，肥胖和急性肺損傷。Cer可通過(guò)鞘磷脂酶催化膜鞘磷脂的分解生成，或通過(guò)Cer合成酶從頭合成釋放[9]。在機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中，鞘磷脂被催化分解是最重要、最直接以及最快生成Cer的途徑，鞘磷脂酶是此途徑的調(diào)控關(guān)鍵酶。鞘磷脂酶包括三種同工酶：ASM、中性鞘磷脂酶(Mg2+dependent neutral sphingomyelinase, NSMase)和堿性鞘磷脂酶。其中ASM是被人們研究和認(rèn)識(shí)最廣泛的，且ASM的生物活性占鞘磷脂酶總活性的90%，其對(duì)內(nèi)源性Cer的生成具有重要作用[10]。丙咪嗪是臨床上常見的三環(huán)類抗抑郁藥，也是細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的ASM抑制劑。課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，丙咪嗪可顯著改善由LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的肺部炎癥反應(yīng)。然而，丙咪嗪是否通過(guò)對(duì)ASM/Cer通路的調(diào)控進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用，目前仍不清楚。研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，ASM的蛋白表達(dá)以及神經(jīng)酰胺的含量明顯升高；然而，在給予ASM抑制劑丙咪嗪預(yù)先處理后，ASM的蛋白表達(dá)以及Cer的含量被顯著抑制。這一結(jié)果提示在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中Cer的累積主要源于ASM的激活。進(jìn)一步研究了丙咪嗪對(duì)NLRP3炎癥小體激活的影響，結(jié)果顯示，丙咪嗪顯著抑制了由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)。因此，可以認(rèn)為丙咪嗪作為ASM的抑制劑可通過(guò)對(duì)ASM/Cer通路的調(diào)控進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的激活。

IL-1β和IL-18是兩種非常重要的促炎因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，限制炎癥因子的表達(dá)便可實(shí)現(xiàn)抗炎作用。已經(jīng)證實(shí)IL-1β和IL-18的分泌需要NLRP3炎癥小體的參與[7]。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞上清液中兩者的分泌水平。正如所預(yù)期的，在LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞中IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞上清液中兩者的分泌水平都顯著升高；然而，在給予丙咪嗪預(yù)先處理后，顯著抑制了兩者在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)以及細(xì)胞上清液中兩者的分泌水平。這一結(jié)果表明丙咪嗪通過(guò)限制NLRP3炎癥小體的激活從而抑制IL-1β和IL-18的表達(dá)。

綜上，本研究表明ASM/Cer通路在NLRP3炎癥小體形成和活化中起關(guān)鍵作用，丙咪嗪作為ASM的抑制劑可通過(guò)對(duì)ASM/Cer通路的調(diào)控進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用。然而，丙咪嗪對(duì)于LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用可能涉及其他機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。