NLRC5抑制自噬促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的研究

姚 順，詹 磊，孫士瑩，王文艷，衛(wèi) 兵

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)作為最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)癌癥之一，是第六大腫瘤死亡原因，而且EC在年輕女性中的發(fā)病率正在上升，流行病學(xué)調(diào)查顯示每年全世界有超過(guò)280 000個(gè)女性被診斷為EC患者[1]。目前臨床上EC的治療主要包括外科手術(shù)、放化療以及藥物治療，但這些治療方式療效均不是很好[2]。NLR家族含CARD結(jié)構(gòu)域5[NOD like receptor (NLR) family, caspase recruitment(CARD) domaincontaining 5,NLRC5]，又稱MHC I反式激活因子，是2010年新發(fā)現(xiàn)的NLRs樣受體家族中的受體之一[3]。最新研究[4]發(fā)現(xiàn)，NLRC5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，且NLRC5的水平與腫瘤患者發(fā)病率與存活率相關(guān)。但NLRC5對(duì)EC的作用及其機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，自噬可以參與NLRs的調(diào)節(jié)過(guò)程[5-6]。自噬是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡形式，是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)及細(xì)胞器降解的過(guò)程[7]。其過(guò)程需要依賴自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1等的參與[8]。大量研究[9]證實(shí)自噬與腫瘤之間存在密切的聯(lián)系而且自噬在腫瘤的治療中具有潛在作用。但自噬是否參與NLRC5的調(diào)節(jié)過(guò)程目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。該研究探討NLRC5是否通過(guò)調(diào)控自噬在EC細(xì)胞中發(fā)揮作用，以期為該病的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人子宮內(nèi)膜腺癌AN3CA細(xì)胞株(上海Sigma公司)由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、含1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(美國(guó)Gibico公司)，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.1.2標(biāo)本收集 收集EC患者手術(shù)切除的EC組織標(biāo)本及門診病理顯示正常的子宮內(nèi)膜標(biāo)本各20例，術(shù)前均未接受性激素的治療或輔助放化療。EC標(biāo)本20例為實(shí)驗(yàn)組，選取病例年齡為45～65(52±5.42)歲，平均年齡52歲。病理類型均為腺癌，手術(shù)病理分期為Ⅰ期。正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本20例作為對(duì)照組，且與研究組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)前均未接受性激素的治療。標(biāo)本在獲取知情同意后取自安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科臨床診斷明確的患者。符合倫理學(xué)要求(倫理編號(hào)：LLSC20180085)。

1.1.3主要試劑 NLRC5 (ab105411)兔多克隆抗體、Beclin1兔單克隆抗體、LC3B[EPR18709]兔單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；ECL發(fā)光試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(美國(guó)affinity公司)；PVDF 膜(上海Biosharp公司)；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)抗體(南京金斯瑞生物科技)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)；GADPH、NLRC5、Beclin1、LC3引物序列(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)；NLRC5質(zhì)粒(武漢賽維爾生物科技有限公司構(gòu)建)；免疫組化試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)；高糖DMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；PBS(美國(guó)Hyclone 公司)；jetPRIME?試劑(法國(guó)Polyplus-transfection公司)；胰蛋白酶、50×TAE 緩沖液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、Tris-HCl pH 8.8、Tris-HCl pH 6.8、青霉素、鏈霉素(上海碧云天公司)。

1.1.4主要儀器 Heraeus CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；FlexCycler多功能PCR儀(德國(guó)Jena公司)；生物安全柜、電泳儀(上海天能科技有限公司)；TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 收集正常子宮內(nèi)膜組織及EC組織，組織石蠟切片脫蠟后，經(jīng)微波爐修復(fù)表面抗原、3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶、山羊血清封閉，加一抗：NLRC5抗體、Beclin1抗體、LC3抗體，4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗(HRP標(biāo)記)，室溫孵育50 min，滴加鏈親和素—過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，滴加新鮮配制的DAB混合染液，室溫避光染色10 min，顯微鏡下觀察顏色。每組標(biāo)本隨機(jī)選取若干個(gè)目的區(qū)域，通過(guò)Image-Pro-Plus 6.0分析系統(tǒng)分別計(jì)算各組樣本中NLRC5、Beclin1、LC3著色陽(yáng)性面積百分比(%)，取均值進(jìn)行比較。

1.2.2Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取組織及細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后，按10 μl/孔的量加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。孵一抗：各蛋白抗體分別參考抗體說(shuō)明書進(jìn)行操作，4 ℃ 孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min。孵二抗：相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光、顯影，以β-actin為內(nèi)參，分析各指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3qRT-PCR法檢測(cè)mRNA水平 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，按TRIzol試劑說(shuō)明書提取總RNA，測(cè)RNA的OD260 mm/OD280 mm比值及濃度，再以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green試劑盒進(jìn)行qRT-PCR,每組樣本應(yīng)重復(fù)檢測(cè)3次。GADPH引物序列上游引物：5′-GGTTGAGCAGGTACTTT-3′;下游引物:5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′。NLRC5引物序列上游引物：5′-CTATCAACTGCCCTTCCACAAT-3′;下游引物:5′-TCTCTATCTGCCCACAGCCTAC-3′。Beclin1引物序列上游引物:5′-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3′;下游引物:5′-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3′。LC3引物序列上游引物:5′-AGCAGCATCCAACCAAAATC-3′;下游引物:5′-CTGTGTCCGTTCACCAACAG-3′。以上引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.4CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將轉(zhuǎn)染24、48、72 h后的細(xì)胞接種在96孔板中(100 μl/孔)，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后每孔中加10 μl的CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 mm處吸光度值測(cè)定各組細(xì)胞的增殖情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以實(shí)驗(yàn)測(cè)得的均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5質(zhì)粒構(gòu)建 NLRC5質(zhì)粒(其序列如下：上游引物:5 -CCGGAATTCCGGATGGCCAGGAAGCTGGA-3，下游引物:5-GGGATCCCGTCACCTGAGTGTCTTCCCA-3)由武漢賽維爾生物科技有限公司構(gòu)建，經(jīng)鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。

1.2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度為70%時(shí)，使用jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑并參考其說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將2 μg NLRC5質(zhì)粒稀釋至200 μl緩沖液中，通過(guò)上下吸管混合。加入4 μl jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑，渦旋10 s，低速離心數(shù)秒，在室溫孵育10～15 min。取出6孔板，每孔中加入2 ml含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物添加至含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 h用含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用于后續(xù)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織與EC組織中NLRC5及自噬因子表達(dá)收集EC組織標(biāo)本和正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本各20例，免疫組化結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，NLRC5蛋白在EC組織中表達(dá)相對(duì)較低，而自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3在EC組織中表達(dá)相對(duì)較高，見(jiàn)圖1。同時(shí)Western blot結(jié)果分析顯示EC組織與正常子宮內(nèi)膜相比， NLRC5蛋白表達(dá)相對(duì)較低，而自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3相對(duì)較高，見(jiàn)圖2，各指標(biāo)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

圖1 正常子宮內(nèi)膜組與EC組NLRC5、Beclin1、LC3免疫組化 ×200

表1 正常子宮內(nèi)膜組與EC組NLRC5、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)水平

2.2 NLRC5對(duì)AN3CA細(xì)胞自噬的作用轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，自噬蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達(dá)水平降低(圖3、4)；各指標(biāo)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、3)。

表2 未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組NLRC5、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)水平

2.3 NLRC5對(duì)EC細(xì)胞(AN3CA)細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后分別用CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯增加，見(jiàn)圖5。各指標(biāo)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

圖2 Western blot法檢測(cè)組織蛋白表達(dá)情況

1、2、3：正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本；4、5、6：EC標(biāo)本；與正常子宮內(nèi)膜組比較：*P<0.05

圖3 Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)NLRC5細(xì)胞蛋白表達(dá)情況

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)NLRC5細(xì)胞中NLRC5、Beclin 1、LC3 mRNA水平

表3 未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平

圖5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

表4 CCK-8檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組AN3CA細(xì)胞活力

2.4 NLRC5促進(jìn)AN3CA細(xì)胞增殖的機(jī)制本實(shí)驗(yàn)分四組，兩組轉(zhuǎn)染組和兩組未轉(zhuǎn)染組，其中一組轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒24 h后加自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(50 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后分別用CCK-8法檢測(cè)4組細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細(xì)胞增殖明顯增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后同時(shí)加雷帕霉素組與只轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細(xì)胞自噬水平升高，但細(xì)胞增殖明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖6。轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較，0、24、48 h的F值分別為17.72、80.73、145.8，與轉(zhuǎn)染同時(shí)加雷帕霉素組比較，24 h、48 h的F值分別為13.06、17.62，各指標(biāo)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

圖6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

與未轉(zhuǎn)染組比較：*P<0.05；與轉(zhuǎn)染同時(shí)加雷帕霉素組比較：#P<0.05

表5 CCK-8檢測(cè)各組AN3CA細(xì)胞活力

與未轉(zhuǎn)染組比較：*P<0.05；與轉(zhuǎn)染+雷帕霉素組比較：#P<0.05

3 討論

EC是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，位居女性常見(jiàn)癌癥的第六位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)每年有超過(guò)20萬(wàn)的EC新增病例，其發(fā)病率和死亡率逐年增高，并且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害女性的身心健康[10]。但是，其影響機(jī)制尚不明確。

NLRC5是2010年新發(fā)現(xiàn)的NLRs樣受體家族中的受體之一[3]。NLRC5在多種腫瘤中表達(dá)相對(duì)偏低，而NLRC5在肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌以及腦部腫瘤中相對(duì)偏高[11]。Peng et al[12]發(fā)現(xiàn)NLRC5可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。但是NLRC5是否可能參與EC的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究NLRC5的表達(dá)變化，觀察其是否可能參與EC發(fā)生發(fā)展，并初步探討其可能的作用機(jī)制。為觀察NLRC5在EC中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織，免疫組化及Western blot結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，在EC中，NLRC5蛋白表達(dá)是下調(diào)的。為了證實(shí)NLRC5與EC間的關(guān)系，本研究CCK-8結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯增加。綜上所述，NLRC5可能促進(jìn)EC細(xì)胞的增殖，但其如何影響EC細(xì)胞增殖，機(jī)制尚不明確。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，自噬參與NLRs的調(diào)節(jié)過(guò)程[5-6]。自噬是一種保守的溶酶體降解途徑，在此過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)被降解和再循環(huán)[13]。自噬已被證實(shí)對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要的作用，但結(jié)論仍存在爭(zhēng)議，最初認(rèn)為自噬是腫瘤抑制機(jī)制，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌細(xì)胞中自噬抑制腫瘤發(fā)生[14]。但是，在肝癌早期階段，自噬可破壞腫瘤組織以達(dá)到抑制腫瘤增殖的作用，當(dāng)癌細(xì)胞劇增達(dá)到腫瘤晚期階段時(shí)，自噬降解的受損細(xì)胞器又為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)支持，使癌細(xì)胞不斷繁殖[15]。因此自噬在癌癥中的作用是復(fù)雜的，并且受背景條件的影響[13]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化及Western blot結(jié)果顯示EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織比較，在EC組織中自噬蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達(dá)水平上調(diào)。那么自噬是否參與NLRC5的調(diào)節(jié)，目前尚不清楚。為探究NLRC5是否可能通過(guò)調(diào)控自噬在EC中發(fā)揮作用，選擇AN3CAEC細(xì)胞株作為體外實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，自噬蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達(dá)水平下調(diào)。進(jìn)一步研究該途徑如何影響EC的作用，本研究CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細(xì)胞增殖明顯增加；轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后同時(shí)加雷帕霉素組與只轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細(xì)胞自噬水平升高，但細(xì)胞增殖明顯下降。以上研究結(jié)果表明NLRC5可能通過(guò)抑制自噬進(jìn)而促進(jìn)EC細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在EC組織標(biāo)本中NLRC5的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達(dá)水平上調(diào)；過(guò)表達(dá)NLRC5后，EC細(xì)胞自噬水平下降，但EC細(xì)胞增殖升高；相反，過(guò)表達(dá)NLRC5后，提高自噬水平，細(xì)胞增殖反而下降。因此，NLRC5可能通過(guò)抑制自噬促進(jìn)EC細(xì)胞增殖，NLRC5可能成為EC治療的新靶點(diǎn)。