赤芝靈芝多糖與重金屬元素的質(zhì)量評價(jià)研究

姜 濤，施枝江，羅 安，黃發(fā)軍，姚藝新，陳純純，翁玉萍

(康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 揭陽 515300)

靈芝來源于多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(leyss. ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實(shí)體，性平、味甘，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有“補(bǔ)氣安神，止咳平喘”之功效，臨床上用于治療心神不寧、失眠心悸、肺虛咳喘、虛勞短氣、不思飲食等[1]?，F(xiàn)代研究表明，靈芝中含有多糖、三萜類化合物、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[2-9]。目前市面上流通的靈芝以赤芝用量較大，靈芝多糖是靈芝的有效成分之一，2015版《中國藥典》評測靈芝多糖含量以無水葡萄糖(C6H12O6)的含量來計(jì)算，且以不得少于0.90%作為評價(jià)指標(biāo)之一[1]。近年來，中藥的安全性成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。2001年我國對外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部頒布的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》對藥用植物原料、飲片中的鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)、銅(Cu)、砷(As)實(shí)施了限量要求[10]，說明這5種重金屬元素的含量是評價(jià)藥材重金屬安全性的重要內(nèi)容。目前《中國藥典》2015版未對重金屬元素進(jìn)行限量要求，現(xiàn)有的文獻(xiàn)研究更多側(cè)重于微量元素的測定，未對赤芝的安全性評價(jià)進(jìn)行全面研究，更未對其有效成分與重金屬元素進(jìn)行相關(guān)性分析[11-13]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、精密度高、檢出限低，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[14，15]。為此，本研究通過建立測定赤芝靈芝多糖的紫外分光光度法和5種重金屬含量的ICP-MS法，測定含量，運(yùn)用主成分分析法比較不同樣品重金屬元素的差異，并結(jié)合多元相關(guān)性分析法研究靈芝多糖與5種重金屬之間的相關(guān)性，以期為赤芝的質(zhì)量評價(jià)提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試劑及藥材

UV-2501PC紫外可見分光光度計(jì)(島津公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州恒隆儀器有限公司)；XS105DU型電子天平(d=0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300VDB三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；安亭DL-5-B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DGG-9030B鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Multiwave PRO微波消解儀為奧地利安東帕公司生產(chǎn)；ICP-MS 7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀為安捷倫科技有限公司生產(chǎn)。

D-無水葡萄糖(批號：110833-201506)購于中國食品藥品檢定研究院(北京)；Pb(批號GSB04-1742-2004 )、Cd(批號GSB04-1721-2004)、Hg(批號 GSB04-1729-2004)、Cu (批號GSB04-1525-2004 )、As (批號GSB04-1714-2004)、Cr(批號GSB04-1723-2004)、Ge(批號GSB04-1728-2004 )、In(批號GSB04-1731-2004)、Bi(批號GSB04-1719-2004)、Au(批號GSB04-1715-2004)標(biāo)準(zhǔn)液均由國家有色金屬及電子材料分析測試中心生產(chǎn)；無水甲醇、冰醋酸、苯酚、高氯酸、冰醋酸、乙酸乙酯、香草醛均為分析純，由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；鹽酸、活性炭、碘化鉀、硫酸均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；丙酮、無水乙醇、乙醚均為分析純，由廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)；硫氰酸鉻銨由上海華精生物高科技有限公司生產(chǎn)。

14份赤芝藥材樣品分別從安徽各地收集，由康美藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量管理部劉茂貴主任藥師鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(leyss. ex Fr.)Karst的子實(shí)體。樣品信息見表1。

表1 14份赤芝樣品靈芝多糖和5種重金屬元素的含量及綜合得分

注：F值為主成分分析的綜合得分值。

2 方法

2.1 靈芝多糖的含量測定

2.1.1 對照品溶液的配制 取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻)6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白對照，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得A=0.027 54X+0.022 06，r=0.999 0。

2.1.3 供試品溶液的配制 取本品粉末約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60 mL靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘?jiān)盟? mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻，在4 ℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

政治文本中的隱喻翻譯研究——以《2016年政府工作報(bào)告》為例 衛(wèi)明高,余高峰,喬俊凱 40(2)120

2.1.4 靈芝多糖的方法學(xué)考察 精密度考察：取同一份靈芝樣品供試液，連續(xù)6次測定吸光度，其RSD為0.45%(n=6)，表明儀器的精密度良好。穩(wěn)定性考察：取同一份靈芝樣品的供試液，分別于制備后0、10、20、40、60、80、120 min 測定吸光度，其RSD為1.34%(n=7)，表明所用供試液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性考察：取同一份靈芝樣品粉末6份，制備成供試液，測定靈芝多糖的含量，其RSD為1.65%(n=6)，表明所用方法的重復(fù)性良好。加樣回收試驗(yàn)：精密稱取2 g已測定靈芝多糖含量的靈芝樣品粉末6份，分別精密加入與樣品中靈芝多糖含量相當(dāng)?shù)臒o水葡萄糖對照品溶液，制備供試液，測定靈芝多糖的含量，其平均回收率為98.24%，RSD為1.68%(n=6)，表明所用方法的準(zhǔn)確性良好。

2.1.5 樣品測定 精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“2.3.2”項(xiàng)下“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計(jì)算，即得。

2.2 Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量測定

2.2.1 鉛、鎘、砷、銅、汞標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的制備 分別精密量取鉛、砷、鎘、汞、銅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成1 mL分別含鉛、砷、鎘、汞、銅為1 μg、0.5 μg、1 μg、1 μg、10 μg的溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取鍺、銦、鉍單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水稀釋制成每1 mL各含1μg的混合溶液，即得。

2.2.3 ICP-MS的測定條件 等離子氣流量：15.0 L·min-1；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.20 r·s-1；霧化室溫度：2 ℃；輔助氣流量：0.8 L·min-1；He氣流量：5 mL·min-1；載氣流量：0.8 L·min-1；射頻功率：1 550 W；數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式；采樣深度：10 mm；重復(fù)次數(shù)：3次；描次數(shù)：100次。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取鉛、鎘、銅、砷標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成每1 mL含鉛、砷0 ng、1 ng、5 ng、10 ng、20 ng，含鎘0 ng、0.5 ng、2.5 ng、5 ng、10 ng，含銅0 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列濃度混合溶液，即得。另精密量取汞標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，用10%硝酸溶液稀釋制成每1mL分別含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5 ng的溶液，本液應(yīng)臨用配制。63Cu、75As以72Ge作為內(nèi)標(biāo)，114Cd以115In作為內(nèi)標(biāo)，202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見表2。

表2 重金屬元素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2.5 供試品溶液的制備 取供試品于60 ℃干燥2 h，粉碎成粗粉，取0.5 g，精密稱定，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5～10 mL(如果反應(yīng)劇烈，放置至反應(yīng)停止)。密閉并按微波消解儀的相應(yīng)要求及一定的消解程序進(jìn)行消解。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(如有少量沉淀，必要時(shí)可離心分取上清液)。除不加金屬元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，余同法同時(shí)制備試劑空白溶液。

2.2.6 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣 6次，測定這5種元素的量，Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD分別為 3.12%、1.54%、1.66%、1.17%、2.12%、2.33%。表明儀器的精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)：取同一份赤芝樣品粉末6份，制備成供試品溶液，測定這6種元素的量。Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD值分別為1.21%、2.11%、1.15%、1.38%、2.54%，表明此方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份赤芝樣品供試液，在選定樣品測定條件下，分別于制樣后 0、5、10、15、20、25、30、35 h 進(jìn)樣，測定這5種元素的量。Pb、Cd、Hg、Cu、As的RSD值分別為1.38%、1.52%、2.01%、2.22%、2.96%，表明在樣品制備35 h內(nèi)各成分是穩(wěn)定的。

3 結(jié)果與分析

3.1 赤芝中靈芝多糖含量的比較

14份赤芝樣品靈芝多糖的含量均符合2015年《中國藥典》的要求，含量范圍為0.95% ～ 2.55%，平均值為1.35%(n=14)。

3.2 赤芝5種重金屬元素含量的比較

14份赤芝鉛元素有2份樣品未檢出，平均值為0.12 mg/kg(n=14)；鎘元素有4份樣品未檢出，平均值為0.12 mg/kg(n=14)；砷元素有1份樣品未檢出，平均值為0.07 mg/kg(n=14)；汞元素有6份樣品未檢出，平均值為0.02 mg/kg(n=14)；銅元素有5份樣品未檢出，平均值為3.41 mg/kg(n=14)。

把14份赤芝5種重金屬元素含量的結(jié)果代入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，設(shè)置提取因子數(shù)目為5，進(jìn)行主成分分析，得到解釋的總方差和成分矩陣，結(jié)果見表3、表4。

表3 解釋的總方差 (%)

注：提取方法為主成分分析。

表4 成分矩陣a

注：a.提取方法為主成分分析；已提取了5個(gè)成分。

分析表3總方差的解釋和表4成分矩陣，結(jié)果表明，5個(gè)主成分的初始特征值分別為1.768、1.496、1.013、0.525、0.198，累積百分比為100%，計(jì)算得到主成分1、2、3、4、5的表達(dá)式分別為：

Z1=0.801*Pb+0.69*Cd+0.706*As+0.329*Hg+0.208*Cu

Z2=0.458*Pb-0.441* Cd-0.569*As+0.791*Hg+0.379*Cu

Z3=0.017*Pb-0.226* Cd+0.151*As-0.441*Hg+0.863*Cu

Z4=-0.283*Pb+0.521* Cd-0.313*As+0.108*Hg+0.252*Cu

Z5=-0.261*Pb-0.081* Cd+0.241*As+0.246*Hg+0.068*Cu

把5個(gè)主成分相加，得到總的表達(dá)式Z總=2.303*Pb+0.589*Cd+0.433*As+1.424*Hg+1.955*Cu，把5種重金屬元素的含量代入Z總，得到每份樣品的綜合得分值，詳見表1。

14份赤芝5種重金屬元素的主成分分析的結(jié)果有所不同，綜合得分值越高，安全性越低。1～14號樣品的綜合得分值分別為9.227、0.238、10.944、6.344、2.025、0.091、0.549、18.551、10.848、12.671、0.548、0.193、15.202、10.962，說明不同赤芝樣品之間的重金屬方面的安全性不同。

3.3 赤芝靈芝多糖與重金屬元素的相關(guān)性分析

把5種重金屬元素的含量作為自變量，靈芝多糖的含量作為因變量，帶入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行逐步回歸分析，結(jié)果見表5至表8。

表5 輸入/移去的變量b

注：已輸入所有請求的變量；因變量：靈芝多糖。

表6 模型匯總

注：a. 預(yù)測變量：(常量)，銅，砷，汞，鎘，鉛。

表7 ANOVAb

注：a.預(yù)測變量：(常量)，銅，砷，汞，鎘，鉛；b.因變量：靈芝多糖。

表8 系數(shù)a

注：a. 因變量：靈芝多糖。

從表8可以看出，只有鎘元素與靈芝多糖的相關(guān)性通過可靠性分析，P=0.045<0.05，相關(guān)系數(shù)為-0.025，說明鎘元素與靈芝多糖呈負(fù)相關(guān)，二者的表達(dá)式為：Y(靈芝多糖)=-0.025*X(鎘元素)+0.012。

產(chǎn)地、菌種、菌絲體、菌株對靈芝中靈芝多糖的含量都有不同程度的影響[16-20]。而生長期對靈芝中靈芝多糖含量影響較大，現(xiàn)蕾期時(shí)最高，芝蓋形成期有所降低，成熟期又有所增加，衰老期又大幅度降低[21]。在生長過程中，UDPGPPlase、α-PGM和PGI是靈芝多糖合成的關(guān)鍵酶[22]，各部位基質(zhì)中的靈芝胞外酶活性與物質(zhì)量具有一定的相關(guān)性[23]。靈芝不同部位的多糖含量差異較大，即：發(fā)酵菌絲體>菌蓋表皮層>孢子粉>菌柄>木栓層[24]。不同生長時(shí)期的靈芝用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀靈芝多糖，人工栽培與野生對靈芝多糖也有一定影響[25，26]。這說明產(chǎn)地、菌種、菌絲體、菌株、生長期等對靈芝中靈芝多糖均有不同程度的影響；而不同樣品中5種重金屬元素的含量有所不同，可能與赤芝自身對某些元素的富集或者與環(huán)境的污染有關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)語

本研究建立的赤芝靈芝多糖的紫外分光光度法和5種重金屬元素含量的ICP-MS方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。從藥效的角度來看，不同赤芝樣品的質(zhì)量存在一定差異，從安全性的角度來看，其安全性有所不同。鎘元素與靈芝多糖呈負(fù)相關(guān)，即鎘元素含量越高，靈芝多糖的含量越低。