奶牛DQA2基因序列特征分析

陳朗，彭喬烽，劉云紅，鄭天宇，朱喬峰，劉麗霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompability complex, MHC)是由一組緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座組成的基因群，由Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因組成。Ⅱ類基因含 DQ、DO、DR 等亞區(qū)，其產(chǎn)物參與抗原遞呈和T細(xì)胞激活。牛MHC簡稱BOLA[1]，根據(jù)遺傳分型比較，BOLA II類基因被分成單獨(dú)的區(qū)域Ⅱ類a區(qū)和Ⅱ類b區(qū)，相隔約三分之一染色體長度，這是牛和其他反芻動(dòng)物MHC基因最顯著的特征[2]。Ⅱ類a區(qū)包括功能性MHC Ⅱ類基因DR和DQ。牛有1個(gè)DRA基因座、3個(gè)DRB基因座、5個(gè)DQA基因座和5個(gè)DQB基因座，它們是由于基因復(fù)制而產(chǎn)生的，每個(gè)單倍型表達(dá)1個(gè)DR基因?qū)Γ―RA和DRB）和1或2個(gè)DQ基因?qū)3,4]。在這些基因中，DRB3和DQA基因表現(xiàn)出高度多態(tài)性[5,6]。

近年來，有學(xué)者對(duì)牛DQA2基因多態(tài)性與生產(chǎn)和疾病的相關(guān)性做了大量研究。孫菲菲[7]研究認(rèn)為DQA2外顯子2中的等位基因A對(duì)渤海黑牛的生產(chǎn)性狀起關(guān)鍵作用。Gelasakis[8]發(fā)現(xiàn)Chios奶牛的DQA2等位基因1101的單拷貝和基因型0301/0301與足癬的易感性相關(guān)。張通明[9]通過對(duì)各組表達(dá)譜差異分析，檢出BOLA-DQA2與牛結(jié)核病感染的信號(hào)通路相關(guān)。Kosciuczuk等[10]對(duì)感染凝固酶陽性葡萄球菌的奶牛進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BOLA-DQA2基因多態(tài)性與乳腺炎抗性相關(guān)聯(lián)。這些研究說明DQA2基因可作為牛疾病抗性和易感性研究的候選標(biāo)記基因。

為此，本研究通過測定荷斯坦牛DQA2基因序列再拼接得到CDS區(qū)（Coding sequence）序列，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)荷斯坦牛DQA2基因CDS區(qū)序列編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、N-糖基化位點(diǎn)、信號(hào)肽預(yù)測和蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，旨在為荷斯坦牛DQA2基因結(jié)構(gòu)與功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司牛群中采集中國荷斯坦牛尾靜脈血，每頭采集10mL，低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后-20℃冷凍保存。采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA，提取的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的DQA2基因序列（登錄號(hào)：XM_024983852.1），利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)BoLA-DQA基因4對(duì)引物（表1），引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 BoLA-DQA2基因引物信息表

1.3 基因組DNA混合池構(gòu)建和PCR擴(kuò)增

隨機(jī)選取300個(gè)荷斯坦牛DNA樣品，每50個(gè)樣品構(gòu)建一個(gè)DNA混合池，以混合池DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：PCR反應(yīng)總體積20μL，其中混合DNA1μL，2×Power Taq PCR MasterMix （百泰克）11μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，滅菌超純水補(bǔ)至20μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火（退火溫度見表1）30s，72℃延伸30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表2 BOLA-DQA2基因生物信息學(xué)分析方法

1.4 序列測定與生物信息學(xué)分析

選取擴(kuò)增效果良好的DQA2基因4個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，用MEGA6.0和Editseq軟件比對(duì)和拼接獲得DQA基因CDS區(qū)序列。對(duì)BOLA-DQA基因CDS區(qū)進(jìn)行分析用到的方法及工具見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛DQA2基因4個(gè)外顯子擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可以看出，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶特異性良好，條帶清晰，DQA基因4個(gè)外顯子片段大小均與預(yù)期擴(kuò)增片段相符。

圖1 荷斯坦牛DQA2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果

2.2 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)理化特性預(yù)測與分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成和等電點(diǎn)等，利用Expasy服務(wù)器上的protparam程序預(yù)測結(jié)果見表3。荷斯坦牛DQA2基因編碼254個(gè)氨基酸，20種氨基酸所占比例見圖2?？梢钥闯?，亮氨酸( Leu)最多，占整個(gè)氨基酸組成的10.2%，半胱氨酸( Cys)最少，占1.2%。基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)大于40，表明該基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定[11]。

表3 荷斯坦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì)理化特性

圖2 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成

2.3 荷斯坦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測和分析

運(yùn)用Expasy服務(wù)器上的Protscale程序預(yù)測荷斯坦牛DQA基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性，結(jié)果（圖3）顯示，該蛋白質(zhì)第235位蘇氨酸（Thr）疏水性最強(qiáng)（+3.122），第51位的谷氨酸（Glu）和第52位的苯丙氨酸（Phe）親水性最強(qiáng)（-1.900）。整個(gè)編碼產(chǎn)物中，親水氨基酸占55.28%，疏水氨基酸占45.72%，平均分值為-0.021，表現(xiàn)為親水性，由此可推斷荷斯坦牛DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白質(zhì)。

圖3 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)的疏水/親水性預(yù)測

2.4 荷斯坦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì) N-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測和分析

蛋白質(zhì)糖基化是指在蛋白質(zhì)合成的同時(shí)或合成后，在酶的催化下寡糖鏈被連接在特定的糖基化位點(diǎn)，形成糖蛋白。利用CBS在線分析軟件Net NGlyc 1.0預(yù)測得到，荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)具有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別為 Asn31、Asn96、Asn260、Asn369（圖4）。

圖4 荷斯坦牛 DQA2基因編碼蛋白質(zhì) N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測

2.5 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析

信號(hào)肽位于蛋白質(zhì)N端，一般由16～26個(gè)氨基酸殘基組成[12]。信號(hào)肽分析結(jié)果(圖5) 顯示，DQA2基因編碼蛋白質(zhì)的分值曲線較為典型，其中C值和Y值趨向于+1，S值在剪切位點(diǎn)之前較高而在剪切位點(diǎn)之后變低。荷斯坦牛DQA基因在第1～23位氨基酸之間存在信號(hào)肽，其切割點(diǎn)位于23～24位的氨基酸之間（信號(hào)肽剪切點(diǎn)主要根據(jù)Y最大值大于0.5來判斷）。

圖5 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析

2.6 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用TMHMM程序分析其跨膜結(jié)構(gòu)域，從結(jié)果（圖6）可以看出，DQA2編碼的蛋白質(zhì)共存在1個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，氨基酸序號(hào)為217-239。由此可推測，荷斯坦牛DQA2基因CDS區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)為跨膜蛋白。

圖6 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果

2.7 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈折疊產(chǎn)生的由主鏈內(nèi)和主鏈間周期性氫鍵維系的有規(guī)則構(gòu)象，這些構(gòu)象借助各種次級(jí)鍵共同構(gòu)成其三級(jí)結(jié)構(gòu)。荷斯坦牛DQA基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖7) 顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中α-螺旋(Hh)占9.84%，β-折疊(Ee)占33.07%，無規(guī)則卷曲( Cc)占57.09%。其中Hh＜45%，Ee＞20%，因此判斷荷斯坦牛DQA基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型[13]。其三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖8，顯示該蛋白質(zhì)存在較多的無規(guī)則卷曲，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，同時(shí)也表明DQA2編碼的蛋白質(zhì)由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖7 荷斯坦牛 DQA 基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8 荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

生物的性狀由基因控制，卻通過蛋白質(zhì)直接表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，DQA2基因參與外源性抗原的呈遞，與免疫功能相關(guān)[14]，故DQA2成為與動(dòng)物免疫機(jī)能密切相關(guān)的功能候選基因。侯欽雷[15]指出BOLA-DQA2-SV1在對(duì)奶牛乳腺炎抗性方面有重要作用。邢鳳等[16]發(fā)現(xiàn)魯波山羊GOLA-DQA2基因外顯子2與血液免疫指標(biāo)之間有一定的相關(guān)性。李靈[17]發(fā)現(xiàn)林麝Mobe-DQA2＊03與化膿性疾病的抗性顯著相關(guān)，Mobe-DQA2＊05和Mobe-DQA2＊06與化膿性疾病的易感性呈顯著相關(guān)。Chang等[18]發(fā)現(xiàn)HLA-DQA2位點(diǎn)與臺(tái)灣男性漢族人群的持續(xù)性HBV感染有關(guān)。

對(duì)DQA2基因CDS區(qū)編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析對(duì)了解蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性有重要意義。本研究采用DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測序的方法在荷斯坦牛DQA2基因CDS區(qū)檢測到6個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)。荷斯坦牛DQA2蛋白理論等電點(diǎn)為4.78，由此可判斷荷斯坦牛DQA2蛋白是酸性蛋白質(zhì)。研究表明蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白，反之則為穩(wěn)定蛋白[19]，荷斯坦牛DQA2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.50，屬于不穩(wěn)定蛋白。依據(jù)平均親疏水性分值（-0.021）可判定荷斯坦牛DQA2蛋白是可溶性蛋白。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性取決于蛋白質(zhì)半衰期的長短，荷斯坦牛DQA2基因編碼的蛋白質(zhì)半衰期為30h，但DQA2蛋白仍屬于不穩(wěn)定蛋白，這可能是不同基因調(diào)控所導(dǎo)致的結(jié)果。蛋白質(zhì)糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工的重要修飾之一，蛋白質(zhì)糖基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有重要影響，糖鏈結(jié)構(gòu)不同還將影響蛋白質(zhì)的半衰期和降解[20]。而糖基化位點(diǎn)發(fā)生變化可能與疾病的發(fā)生有關(guān)[21]。荷斯坦牛DQA2基因潛在的糖基化位點(diǎn)有可能與其乳房炎的發(fā)生密切相關(guān)。荷斯坦牛DQA2基因編碼蛋白質(zhì)具有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別為 Asn31、Asn96、Asn260、Asn369。DQA2可能是有胞內(nèi)區(qū)（240aa-254aa）、跨膜區(qū)（217aa-239aa）、胞外區(qū)（1aa-216aa）三部分組成的跨膜蛋白，它可能作為膜受體起作用，也可能是定位在膜上的錨定蛋白質(zhì)或離子通道蛋白質(zhì)。

本研究通過生物信息學(xué)和基因組學(xué)得出荷斯坦牛DQA2基因的功能和結(jié)構(gòu)，可以為今后更好地研究荷斯坦牛的抗病育種提供重要的理論依據(jù)。