基于氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的煙草鮮煙葉代謝組學(xué)分析流程

鄭慶霞，劉萍萍，陳 霞，王 冰，翟 妞，陳千思，金立鋒，路 鑫，徐國(guó)云，張 慧，許國(guó)旺，周會(huì)娜*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧省大連市中山路457號(hào) 116023

煙葉化學(xué)成分與感官品質(zhì)［1-6］、燃燒特性［7］等緊密相關(guān)，其直接或間接來(lái)自鮮煙葉中積累的代謝物質(zhì)，如鮮煙葉中的質(zhì)體色素［8-9］、多酚類物質(zhì)［10-11］、游離氨基酸［12-16］等與烤后煙葉的外觀質(zhì)量、評(píng)吸質(zhì)量以及致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)等緊密相關(guān)。盡管通過(guò)農(nóng)藝栽培措施、常規(guī)育種、基因調(diào)控等手段影響鮮煙葉中的代謝物質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煙葉品質(zhì)的調(diào)控一直是煙草農(nóng)業(yè)的研究熱點(diǎn)，但進(jìn)展較為緩慢，其原因可能在于烤后煙葉化學(xué)成分的形成是鮮煙葉全部代謝物質(zhì)經(jīng)過(guò)調(diào)制后的綜合表現(xiàn)，而目前研究的側(cè)重點(diǎn)則局限于較少的一部分代謝物，且缺乏對(duì)這些代謝物在烤后煙葉化學(xué)形成過(guò)程中的作用與貢獻(xiàn)的綜合評(píng)價(jià)與系統(tǒng)認(rèn)識(shí)。因此為了進(jìn)一步擴(kuò)展對(duì)鮮煙葉代謝物的認(rèn)識(shí)，衡量鮮煙葉代謝物質(zhì)對(duì)烤后煙葉化學(xué)成分、感官品質(zhì)等形成的影響，有必要在組學(xué)水平上開(kāi)展鮮煙葉的代謝物質(zhì)研究。

作為組學(xué)技術(shù)之一，代謝組學(xué)技術(shù)可對(duì)生物體、組織、細(xì)胞等體系內(nèi)的小分子物質(zhì)（小于1 500 Da）進(jìn)行較為系統(tǒng)和全面的分析。當(dāng)前，代謝組學(xué)技術(shù)在農(nóng)作物育種［17-19］、轉(zhuǎn)基因效應(yīng)評(píng)價(jià)［20-21］、生物脅迫與非生物脅迫［22-23］等研究中的應(yīng)用日趨廣泛［24］。煙草代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)在中國(guó)煙草基因組重大專項(xiàng)第一個(gè)五年計(jì)劃期間就已經(jīng)建成并運(yùn)行，而隨著第二個(gè)五年計(jì)劃的實(shí)施及功能基因研究的全面展開(kāi)，代謝組技術(shù)在評(píng)價(jià)鮮煙葉內(nèi)在變化、快速篩選編輯煙株及評(píng)估分析基因功能等方面的應(yīng)用需求迫在眉睫；同時(shí)隨著多家單位合作的深入，也對(duì)不同單位產(chǎn)生數(shù)據(jù)的一致性和可比性提出了更高的要求。因此有必要對(duì)煙草代謝組學(xué)研究從樣品采集到數(shù)據(jù)分析建立統(tǒng)一的操作流程，以便于進(jìn)一步普及煙草代謝組學(xué)研究技術(shù)，加快煙草基因研究和精準(zhǔn)育種進(jìn)程。

在代謝組學(xué)研究中，往往采用多種檢測(cè)方法以期盡可能地彌補(bǔ)單一檢測(cè)技術(shù)對(duì)代謝物檢測(cè)的局限性和偏向性［25］，目前較多采用的代謝組檢測(cè)技術(shù)有 NMR［26］、GC-MS［27］和 LC-MS［28］等。在醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)中已經(jīng)有比較全面的代謝組學(xué)檢測(cè)方法［29-30］可以參照，在植物代謝組學(xué)領(lǐng)域尤其是煙草代謝組學(xué)研究方面尚沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一可供參考的代謝組學(xué)檢測(cè)流程。因此，基于煙草代謝組學(xué)的特殊性及儀器的普及性和可操作性，本研究中建立了基于GC-MS和LC-MS技術(shù)的煙草鮮煙葉代謝組學(xué)檢測(cè)分析流程，方法涵蓋煙葉中常見(jiàn)的初生及次生代謝產(chǎn)物500余種，旨在促進(jìn)煙草代謝組學(xué)的推廣及應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2014年分別在云南祥云、貴州遵義和河南襄縣三地同時(shí)種植紅花大金元、中煙100和K326，采集其旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、盛花期、下部葉成熟期、中部葉成熟期前、中部葉成熟期6個(gè)生育期第十葉位煙葉后，迅速用帶有編號(hào)的錫箔紙包裹后在液氮中速凍，10 min后轉(zhuǎn)移并包埋于裝有足量干冰的加厚泡沫箱中，快速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)箱檢查后，將尚有充足干冰余存且冷凍狀態(tài)保持較好的樣品于-80℃超低溫冰箱中保存。

甲酸、乙腈、無(wú)水乙醇、正己烷、氯仿、甲醇、異丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸（色譜純，美國(guó)Merck、Fisher、J T Baker公司）；丙酮、甲酸銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、三乙胺（AR，上海麥克林生物科技有限公司）。衍生化試劑MSTFA［N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺］和BSTFA［N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺］（＞99.0%，美國(guó)Sigma Aldrich公司）。各標(biāo)準(zhǔn)品分別購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich、Chromadex、Acros Organics公司和加拿大TRC公司等。

BSA2245-CW型電子分析天平（感量0.000 1 g，德國(guó)Sartorius公司）；K20Nx型恒溫培養(yǎng)振蕩器（杭州博日科技有限公司）；5424型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；KQ-700DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；25EL型真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Virtis公司）；N-EVAPTM112型氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；MJ-35BE01A型攪拌機(jī)（美的集團(tuán)有限公司）；1260型高效液相色譜儀、7890/5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀、1290/6540型液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；Thermo TRACE 1300/TSQ8000型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、SPD111V型真空濃縮儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Acquity UPLC-SQD型液相色譜-單四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉樣品處理

從超低溫冰箱中取出煙葉冷凍樣品，在液氮冷卻下初步粉碎、混勻，分為兩部分：一部分作為冷凍鮮煙葉樣品繼續(xù)于-80℃保存，使用前于研缽中在液氮冷卻下研磨成粉末；另一部分煙葉樣品經(jīng)真空冷凍干燥后放入攪拌機(jī)中粉碎成粉末狀，裝入50 mL離心管中密封，于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 煙葉代謝組檢測(cè)

為了盡可能多地檢測(cè)出鮮煙葉中的代謝物，除了使用液相色譜對(duì)植物色素進(jìn)行檢測(cè)外，文獻(xiàn)及本研究中基于LC-MS和GC-MS技術(shù)建立了針對(duì)不同極性、不同物質(zhì)種類的多種檢測(cè)方法，如表1所示。其中靶向檢測(cè)方法5項(xiàng)，非靶向檢測(cè)方法3項(xiàng)，這些方法中，方法2（多酚/類黃酮檢測(cè)）、方法3（脂類檢測(cè)）、方法6（萜類檢測(cè)）、方法8（非靶向GC-MS檢測(cè)）相關(guān)文獻(xiàn)［31-34］中已有詳細(xì)描述，以下主要對(duì)其他4種方法進(jìn)行描述。

1.2.2.1 煙葉樣品中的色素測(cè)定

冷凍鮮煙葉樣品和凍干鮮煙葉樣品色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照 YC/T 382—2010［31］的方法測(cè)定。

1.2.2.2 基于LC-MS平臺(tái)的煙葉代謝組檢測(cè)

方法1-游離氨基酸：準(zhǔn)確稱取凍干煙葉粉末35 mg于2 mL離心管中，加入2 mL提取液（70%的乙醇，含內(nèi)標(biāo)正纈氨酸，濃度為5 mg/L）；置于搖床中，160 r/min、25 ℃，提取1 h，提取液3 000 r/min離心15 min后，再用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾；采用Waters AccQ-Tag derivation kit試劑盒進(jìn)行衍生，之后按照李好麗等［36］的方法進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析。

表1 基于LC-MS和GC-MS技術(shù)的煙草代謝組學(xué)檢測(cè)方法Tab.1 Analysis methods for tobacco metabolomics based on LC-MS and GC-MS

方法4-基于LC-MS平臺(tái)的非靶向分析：準(zhǔn)確稱取20 mg凍干煙葉粉末于2 mL離心管中，加入1.5 mL提取液（75%的甲醇，含內(nèi)標(biāo)傘形花內(nèi)酯，濃度為2.5 mg/L），室溫超聲提取60 min，提取液12 000 r/min離心15 min；取上清液1 mL轉(zhuǎn)移到2 mL樣品瓶中，進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析。分析條件：

色譜柱：Agilent-Zorbax SB C18柱（2.1 mm×100 mm，填充物粒徑1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；線性洗脫程序：2 min內(nèi)流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)從15%上升至30%，2～10 min從 30%上升至 85%，10～15 min從85%上升至90%，17 min后上升至100%并保持3 min，然后回到初始比例，平衡4 min；流速：0.3 mL/min；柱溫：60℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：200～400 nm。檢測(cè)模式：正離子模式；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：12 L/min；噴霧器壓力：275.6 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：10 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：480 V；錐孔電壓：65 V；碎裂電壓：130 V；八極桿射頻電壓：750 V；質(zhì)量范圍（m/z）：50～1 000 Da。

1.2.2.3基于GC-MS平臺(tái)的煙葉代謝組檢測(cè)

方法5-生物堿：準(zhǔn)確稱取150 mg凍干煙葉粉末于15 mL螺口耐壓試管中，加入1.75 mL 5%氫氧化鈉溶液，濕潤(rùn)樣品，靜置15 min；加入10 mL 0.01%的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加蓋密封后在室溫下超聲萃取15 min，然后6 000 r/min離心5 min。取2 mL有機(jī)相，GC-MS法分析煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)；準(zhǔn)確移取5 mL有機(jī)相，濃縮至0.5 mL，GCMS法分析其他低質(zhì)量分?jǐn)?shù)生物堿。煙堿和其他低質(zhì)量分?jǐn)?shù)生物堿的檢測(cè)分兩次進(jìn)樣完成，采用保留時(shí)間和選擇離子（SIM）模式定性，雙內(nèi)標(biāo)定量。分析條件：

色譜柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.)；程序升溫：（10 min）；載氣：氦氣；柱流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；煙堿檢測(cè)進(jìn)樣量：1μL，分流進(jìn)樣，分流比40∶1；其他生物堿檢測(cè)進(jìn)樣量：2μL，分流進(jìn)樣，分流比10∶1。溶劑延遲：8 min；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIM），生物堿的選擇離子見(jiàn)表2。

表2 GC-MS檢測(cè)生物堿的保留時(shí)間及定性、定量離子Tab.2 Retention times and single ion monitoring(SIM)parameters of alkaloid determination by GC-MS

方法7-有機(jī)酸：準(zhǔn)確稱取20 mg凍干鮮煙葉粉末于2 mL離心管中，加入提取液［二氯甲烷∶乙腈=1∶2（體積比），含內(nèi)標(biāo)（E）-2-己烯酸，濃度為0.303 μg/L］1 mL；超聲萃取 60 min，靜置；取 500μL上清液，用氮?dú)獯蹈珊?，加入BSTFA 100μL，60℃衍生40 min，進(jìn)行GC-MS分析。分析條件：

色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm i.d.× 0.25 μm d.f.）；程 序 升 溫 ：80 ℃（0 min）min）；載氣：氦氣；柱流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL，分流進(jìn)樣，分流比20∶1。溶劑延遲：7 min；電離方式：EI；電離電壓：70 eV；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIM），選擇離子見(jiàn)表3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

靶向分析方法：氨基酸分析方法應(yīng)用Empower軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；其他靶標(biāo)方法應(yīng)用MassHunter軟件進(jìn)行處理。經(jīng)軟件處理提取定性和定量離子峰，內(nèi)標(biāo)歸一化后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程對(duì)目標(biāo)代謝物進(jìn)行定量。

LC-Q/TOF非靶向分析方法：應(yīng)用MATLAB高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析工具包，對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜信號(hào)基線校正、峰提取與注釋、峰對(duì)齊等步驟后最終獲得樣品代謝物的保留時(shí)間和精確分子量列表，導(dǎo)入個(gè)人化合物數(shù)據(jù)庫(kù)與譜庫(kù)（Personal compound database and library，PCDL）進(jìn)行搜庫(kù)定性分析，采用內(nèi)標(biāo)歸一化法對(duì)代謝物進(jìn)行相對(duì)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將不同方法采集的代謝物的定性和定量數(shù)據(jù)匯總到一起作為代謝組的初始數(shù)據(jù)，采用ANOVA方差分析篩選差異代謝物，主成分分析使用Simca-14軟件進(jìn)行，對(duì)初始數(shù)據(jù)采用Z-score方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮煙葉冷凍樣品與凍干樣品色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

鮮煙葉樣品凍干前后進(jìn)行稱量，得到失水率，按照失水率計(jì)算冷凍鮮煙葉樣品的取樣量，使冷凍鮮煙葉樣品和凍干鮮煙葉樣品的干物質(zhì)質(zhì)量相同，冷凍鮮煙葉和凍干鮮煙葉各稱取6份，按照YC/T 382—2010［31］的方法測(cè)定煙葉色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如表4所示。除紫黃質(zhì)外，各色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在冷凍鮮煙葉和凍干鮮煙葉之間差異不顯著，表明冷凍干燥對(duì)煙葉色素的影響較?。蛔宵S質(zhì)在鮮煙葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，在凍干鮮煙葉中沒(méi)有檢測(cè)到，可能是由于在凍干過(guò)程中存在一定的降解，使紫黃質(zhì)的量降低到檢測(cè)限以下；稱取的6份冷凍鮮煙葉色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變異較大，除紫黃質(zhì)外，RSD均在20%以上，新黃質(zhì)的RSD更是超過(guò)30%，這可能是由于冷凍煙葉易融化，稱取時(shí)不易操作，難以準(zhǔn)確稱取；相比而言，凍干鮮煙葉的RSD值則均較低，最高的新黃質(zhì)為10.8%，其他均在4%以下。色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果表明，鮮煙葉冷凍干燥對(duì)代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較小，具有較低的RSD值，可以大幅提高測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和可靠性，同時(shí)凍干鮮煙葉可以在室溫下操作，有利于準(zhǔn)確稱取，尤其適宜于大批量鮮煙葉樣本的操作。因此鮮煙葉代謝組學(xué)分析采用凍干煙葉進(jìn)行。

表4 冷凍鮮煙葉與凍干鮮煙葉色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=6）Tab.4 Phytochrome contents in frozen and freeze-dried fresh tobacco leaves（n=6） ［μg·(g·DW)-1］

2.2 方法學(xué)表征

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

按照1.2節(jié)方法分別配制靶向檢測(cè)方法中所含標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度溶液，內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行線性回歸分析。各靶向方法中目標(biāo)物的線性回歸方法及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5～表7?？梢?jiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與相對(duì)峰面積具有良好的線性相關(guān)性，R2均大于0.99。采用稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，分別以3倍和10倍信噪比確定檢出限和定量限。

表5 游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.5 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of free amino acids

表5（續(xù)）

表6 生物堿類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.6 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of alkaloid compounds

表7 有機(jī)酸類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限（LOD）、定量限（LOQ）Tab.7 Standard curves,correlation coefficients,linear ranges,limits of detection,limits of quantitation of organic acids

2.2.2 方法重復(fù)性、儀器精密度及回收率

準(zhǔn)確稱取6份新鮮煙葉樣品粉末進(jìn)行平行處理，測(cè)定4個(gè)靶向方法的重復(fù)性。選擇其中1份樣品連續(xù)進(jìn)樣8次，檢測(cè)儀器的日內(nèi)精密度；將該樣品每天連續(xù)進(jìn)樣8次并重復(fù)4 d，檢測(cè)儀器的日間精密度；用新鮮煙葉樣品粉末作為基質(zhì)，選取高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行4個(gè)靶向方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平分別重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，然后計(jì)算每個(gè)方法的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8～表11。

表8 煙葉游離氨基酸測(cè)定方法的重復(fù)性、日內(nèi)和日間精密度、平均回收率Tab.8 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for free amino acids in tobacco leaves

表8（續(xù)）

表9 煙葉生物堿測(cè)定方法的重復(fù)性、日內(nèi)和日間精密度、平均回收率Tab.9 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for alkaloids in tobacco leaves

表10 煙葉有機(jī)酸測(cè)定方法的重復(fù)性、日內(nèi)和日間精密度、平均回收率Tab.10 Repeatabilities,intra-day precisions,inter-day precisions and recoveries of determination methods for organic acids in tobacco leaves

表10（續(xù)）

表11 非靶向LC-MS測(cè)定方法的重復(fù)性和日內(nèi)、日間精密度Tab.11 Repeatabilities,intra-day precisions and inter-day precisions of untarged LC-MS method

2.3 氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在鮮煙葉代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用

2.3.1 代謝組數(shù)據(jù)采集結(jié)果

利用所建立的基于GC-MS和LC-MS技術(shù)的煙草代謝組學(xué)檢測(cè)方法，共獲得定性定量代謝物522個(gè)。如表12所示，涉及糖代謝、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝等初生代謝途徑，以及苯丙烷代謝、類黃酮代謝、異戊二烯代謝、生物堿代謝等次生代謝途徑，其中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)定量的代謝物有101個(gè)，其他均為相對(duì)定量。

2.3.2 不同產(chǎn)區(qū)不同時(shí)期第十葉位煙葉代謝組表型分析

為了分析第十葉位葉片隨生長(zhǎng)發(fā)育其代謝組的變化情況，將獲取的第十葉位鮮煙葉代謝組數(shù)據(jù)匯總到一起，由于不同代謝物之間質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異較大、定量方式不同等原因，在進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析之前，將數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化（Z-score）處理。主成分分析（PCA）結(jié)果表明，不同時(shí)期、不同產(chǎn)區(qū)煙葉的代謝組有按照產(chǎn)區(qū)聚集的特征。如圖1所示，河南襄縣種植的3個(gè)品種與貴州遵義和云南祥云產(chǎn)區(qū)的代謝組差異明顯，遵義種植的3個(gè)品種則與清香型產(chǎn)區(qū)云南的3個(gè)品種在代謝組上較為接近。從各個(gè)產(chǎn)區(qū)的品種差異來(lái)看，河南襄縣種植的3個(gè)品種在代謝組上的差異最為明顯，尤其是在下部葉成熟期之前的各時(shí)期，3個(gè)品種的代謝組差異較大；云南種植的3個(gè)品種下部葉成熟期之后差異較大；貴州種植的3個(gè)品種中紅大與K326的代謝組較為接近，而與中煙100的代謝組在整個(gè)生育期的差異均較明顯；從生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期來(lái)看，在主成分圖上，各個(gè)產(chǎn)區(qū)不同品種隨生長(zhǎng)發(fā)育的變化情況較為一致；河南產(chǎn)區(qū)從時(shí)期3（盛花期）至?xí)r期4（下部葉成熟期）的代謝組變化最大，這一時(shí)期對(duì)應(yīng)于打頂這一農(nóng)藝措施；相比而言打頂對(duì)貴州和云南產(chǎn)區(qū)煙葉代謝組的影響較小，兩個(gè)產(chǎn)區(qū)煙葉代謝組主要在下部葉成熟期后，不同時(shí)期之間的差異更大，而河南煙葉在這一時(shí)期后代謝組的變化相對(duì)較小。以上分析表明，不同品種種植在同一產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)發(fā)育特征，而同一品種種植在不同產(chǎn)區(qū)其生長(zhǎng)發(fā)育特征差異較大，即產(chǎn)區(qū)的生態(tài)特征對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響大于品種。

表12 鮮煙葉代謝組數(shù)據(jù)采集結(jié)果Tab.12 Identified metabolites from fresh tobacco leaves by metabolomics analysis

圖1 3個(gè)產(chǎn)區(qū)第十葉位6個(gè)關(guān)鍵生育期的代謝軌跡Fig.1 Metabolic trajectory of PCA score plot for the tenth leaves at six key growth stages from three areas

2.3.3 胺類代謝物隨煙葉生長(zhǎng)發(fā)育的累積規(guī)律分析

對(duì)第十葉位鮮煙葉代謝組的進(jìn)一步分析表明，絕大部分代謝物在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的差異均達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。本研究中對(duì)差異顯著的胺類（含游離氨基酸）代謝物進(jìn)行了累積規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)絕大部分胺類物質(zhì)包括游離氨基酸的積累均較有規(guī)律，其中大部分（30種）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均表現(xiàn)出隨生長(zhǎng)發(fā)育逐漸降低的變化趨勢(shì)?？傮w上看，這些胺類代謝物在成熟期煙葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般比旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期等生長(zhǎng)前期（1～3）低，僅有丙酰胺丙氨酸和多巴胺隨生長(zhǎng)發(fā)育其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，其余氨基酸在3個(gè)產(chǎn)區(qū)、3個(gè)品種煙葉中的積累規(guī)律不一致，主要受產(chǎn)區(qū)的影響，即在同一產(chǎn)區(qū)的煙葉中積累規(guī)律較為一致，如色胺，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在河南襄縣煙葉中表現(xiàn)出明顯的隨生長(zhǎng)發(fā)育增加的趨勢(shì)，而在云南祥云煙葉中的趨勢(shì)則相反（圖2）。

圖2 胺類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨煙草生長(zhǎng)發(fā)育的變化趨勢(shì)Fig.2 Variations of amine compound contents in tobacco leaves at different growth stages

3 結(jié)論與討論

采用田間液氮速凍、干冰包埋運(yùn)輸、超低溫保存、冷凍干燥等方法獲取適用于鮮煙葉代謝組分析的樣品；建立了基于GC-MS和LC-MS技術(shù)的鮮煙葉代謝組分析方法，涵蓋多種煙草初生和次生代謝產(chǎn)物；通過(guò)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的歸一化處理進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量，獲得代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)信息；通過(guò)對(duì)多種方法代謝組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合其他統(tǒng)計(jì)分析方法來(lái)篩選、分析關(guān)鍵代謝物，確定了基于GC-MS和LC-MS技術(shù)的鮮煙葉代謝組分析流程，見(jiàn)圖3。

圖3 基于氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的鮮煙葉代謝組分析流程Fig.3 Workflow of metabolomics analysis of fresh tobacco leaves based on GC-MS and LC-MS

對(duì)2014年采集的不同產(chǎn)區(qū)、不同生育時(shí)期的第十葉位鮮煙葉進(jìn)行了代謝組分析，定性鮮煙葉中522種代謝物。主成分分析結(jié)果表明：不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的煙葉代謝組差異較大，隨葉片生長(zhǎng)衰老，不同代謝物表現(xiàn)出不同的積累規(guī)律，多數(shù)胺類物質(zhì)（包括游離氨基酸）隨生長(zhǎng)發(fā)育其質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低；不同產(chǎn)區(qū)、不同品種煙葉具有按照產(chǎn)區(qū)進(jìn)行聚集的特點(diǎn)，即生態(tài)因素對(duì)煙葉代謝組的影響要大于品種因素。這也與烤后煙葉分析的結(jié)果一致，如對(duì)清香型風(fēng)格不同產(chǎn)區(qū)烤煙的研究表明生態(tài)對(duì)煙葉的香味風(fēng)格和化學(xué)成分的影響最大［37］。