半夏胚狀體植株再生最適培養(yǎng)基的篩選研究

陶興魁，高貴珍， 張興桃， 王海潮

宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州， 234000

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)是天南星科半夏屬多年生草本植物，主要分布在我國長江流域以及東北、華北等地區(qū)。在《中國藥典》中收錄的半夏，以干燥塊莖入藥，是一種重要的中藥材[1]。半夏含有多種化學成分，具有多種藥理活性，具有降逆止嘔，抗腫瘤、鎮(zhèn)咳、抗炎等藥理作用[2-3]。半夏野生資源由于過度采挖，瀕臨枯竭，而傳統(tǒng)的人工栽培育種，周期長，繁殖系數(shù)不高，再加上受到病毒的侵害，導致藥材出現(xiàn)產(chǎn)量不足，質量不高，藥效減弱等情況[4-5]。

近些年，國內外的學者利用植物組織培養(yǎng)技術在繁育半夏以及品種改良工作上做了大量工作，取得了很多研究成果，一定程度上緩解了半夏藥材的供應需求[6-7]。吳能表等利用半夏葉片和葉柄誘導愈傷組織，由愈傷組織增殖分化成芽，繼而生根的途徑進行了半夏再生植株的研究[8]。靳松等以半夏莖尖、葉柄和葉片為外植體，研究半夏不定芽和塊莖的形成以及生根，建立了半夏組培快繁體系，為利用生物反應器生產(chǎn)半夏小塊莖提供了理論依據(jù)[9]。饒茜茜等采用荊半夏的葉片、葉柄、珠芽、塊莖作為外植體對荊半夏進行快速繁殖研究，結果表明，荊半夏塊莖的繁殖系數(shù)最高[10]。

目前，前人的研究多是通過外植體—愈傷組織—分化生根的途徑建立半夏組織快繁體系。但是通過半夏外植體—愈傷組織—細胞懸浮培養(yǎng)—試管胚狀體誘導植株再生方面的研究還較少，因此該課題具有良好的應用前景。半夏由外植體誘導疏松愈傷組織，經(jīng)細胞懸浮培養(yǎng)形成球形胚狀體，繼而形成完整植株是組織培養(yǎng)技術的有效途徑，本研究通過試驗設計獲得半夏胚狀體植株再生的最適培養(yǎng)基，為半夏組培快繁技術提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

半夏材料由淮北師范大學資源植物生物學實驗室提供，選用半夏試管苗莖段誘導愈傷組織，進行懸浮培養(yǎng)繼而形成的球形胚狀體。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基

配制MS培養(yǎng)基，1/2 MS(大量元素1/2)、1/4 MS(大量元素1/4)，蔗糖30 g·L-1，pH 5.8液體培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)條件

每種處理接10瓶，做3個重復，在恒溫光照振蕩培養(yǎng)箱中進行振蕩繼代培養(yǎng)，轉速100 r·min-1，培養(yǎng)溫度23 ℃，光照強度2 000 lx，10 h·d-1光照下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計分析胚狀體成苗率。

1.2.3 正交試驗設計

選用1/4 MS、1/2 MS、MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物激素細胞分裂素(KT)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)，采用4因素3水平的L9(34)正交試驗方案配制成液體培養(yǎng)基(見表1)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，胚狀體出苗率=接種胚狀體數(shù)/出苗胚狀體數(shù)×100%。

表1 正交試驗因素水平表L9(34)

2 結果與分析

2.1 半夏胚狀體分化培養(yǎng)基的篩選

培養(yǎng)基編號如表2所示。統(tǒng)計分析結果表明，1、2、3號培養(yǎng)基中的胚狀體出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象即由淡綠色變?yōu)槿榘咨?圖1)，且胚狀體的成苗率比其他6種培養(yǎng)基都低，只有35%～45%。5、6號培養(yǎng)基中胚狀體的成苗率最高，平均值分別達到93.75%和82.27%，且長勢很好(圖2)。4、7、8、9號培養(yǎng)基胚狀體成苗率在60%～75%之間。

圖1 半夏胚狀體分化過程中的白化現(xiàn)象

圖2 半夏胚狀體分化成的試管苗

正交試驗結果的極差R值越大，則該因素影響越顯著。由表2極差分析表明，因子A的R值最大，因子C的R值最小，即MS對胚狀體誘導再生苗的影響最大，而IAA影響最小。4種因素對半夏胚狀體再生植株的影響大小依次為：MS>KT>GA3>IAA。正交表中的均值K越大，則代表該因子的某水平越好。表2結果表明，MS的均值K2>K3>K1，說明當MS大量元素濃度小于1/2時，胚狀體的出苗率隨著MS大量元素的濃度上升而上升；當高于1/2時，成苗率隨著MS大量元素濃度上升而下降，因此1/2 MS最適宜誘導胚狀體成苗。1/2 MS的A2B1C2D3，A2B2C3D1和A2B3C1D2培養(yǎng)基中，狀體誘導成苗最高，平均成苗率可達83.67%。KT的均值K2>K3>K1，說明當KT濃度小于0.5 g·L-1時，胚狀體的成苗率隨KT濃度的上升而上升；KT濃度大于0.5 g·L-1時，胚狀體的成苗率隨著KT濃度的上升而下降，因此KT 0.5 g·L-1為胚狀體再生植株的適宜濃度。

表2 不同培養(yǎng)基對半夏胚狀體誘導再生苗的影響

單從誘導胚狀體成苗率的角度看，極差分析的結果可以得到，半夏胚狀體分化為再生植株培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B2C2D1。通過驗證試驗結果顯示胚狀體的誘導成苗率高達98%(表3)，顯著高于正交表中的9種培養(yǎng)基，從而驗證了A2B2C2D1培養(yǎng)基為半夏胚狀體分化成苗的適宜培養(yǎng)基，即1/2 MS+KT 0.5 g·L-1+IAA 0.5 g·L-1+GA30.2 g·L-1。

表3 驗證試驗結果

通過方差分析(表4)，因子MS、KT對半夏胚狀體誘導再生植株的影響均達到了極顯著(P<0.01)，GA3和IAA對半夏胚狀體誘導再生植株的影響無顯著差異。MS是影響半夏胚狀體分化成苗的主要因素，結果與極差分析的結果相吻合。因此得出，半夏胚狀體分化成苗的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+KT 0.5 g·L-1+IAA 0.5 g·L-1+GA30.2 g·L-1。

表4 試驗結果數(shù)據(jù)的方差分析

3 結 語

細胞分裂素和生長素共同調控植物細胞的生長，當細胞分裂素與生長素的比值較大時，可以促進芽的形成，當細胞分裂素與生長素的比值較小時，可以促進根的生成，但是具體的激素濃度和組合情況則要根據(jù)不同藥用植物的種類、品種、生長發(fā)育狀況等，采用單因素試驗設計、正交設計，通過觀察實驗現(xiàn)象，得出最佳的激素配比[11]。植物的體細胞胚胎是獲得植物再生植株(組培苗)和人工種子，進行植物種群快速繁殖的重要材料[12]。如何高效優(yōu)質地生產(chǎn)植物體細胞胚，通過體胚進行植物再生已成為近些年的熱門研究[13-15]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，1/4 MS培養(yǎng)時，胚狀體分化過程中發(fā)生了白化現(xiàn)象，可能是1/4 MS培養(yǎng)基中的大量元素濃度太低，不能滿足細胞器官分化的需要；MS培養(yǎng)時，胚狀體分化成苗率不高；1/2 MS時，胚狀體的成苗率最高，為最適宜的MS大量元素濃度，說明適當降低大量元素的濃度有利于胚狀體分化成苗。綜合分析正交試驗結果，適宜半夏胚狀體誘導植株再生培養(yǎng)基為：1/2 MS+KT 0.5 g·L-1+IAA 0.5 g·L-1+GA30.2 g·L-1。因素MS，KT對半夏胚狀體誘導再生植株的影響均達到了極顯著，低濃度的KT和IAA有利于胚狀體分化成完整植株，細胞分裂素的存在是胚狀體分化成完整植株的重要因素。GA3和IAA的影響無顯著差異，GA3對半夏胚狀體的分化成苗影響不顯著，可能是因為在大部分植物組織中，內源GA3的含量是足夠的，不需要在培養(yǎng)基中添加額外的GA3。本研究通過液體懸浮培養(yǎng)半夏球狀胚狀體途徑獲得再生試管苗，為半夏的再生體系提供新途徑，新方法，為半夏大規(guī)模細胞培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物的提取奠定基礎。