京尼平苷酸對APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦 內(nèi)淀粉樣蛋白沉積的影響

周張玖智，侯加衛(wèi)，任盟喬，楊光，屈祖衛(wèi)，胡艷麗

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 石河子 832002)

衰老常伴隨蛋白質(zhì)的異常聚集或者淀粉樣化，淀粉樣蛋白沉積與許多神經(jīng)退行性疾病息息相關(guān)[1]。隨著老齡化社會的不斷加劇，神經(jīng)退行性疾病對我國老齡人群的危害日益加劇，阿爾茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) 為眾多神經(jīng)退行性疾病中最常見的一類[2]。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且多樣, 其具體致病機(jī)理尚不清楚，目前大多學(xué)者認(rèn)為AD的核心發(fā)病機(jī)制是β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein, Aβ)的沉積[3]。Aβ生成增加和Aβ清除障礙，均會導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生與清除的失衡，通過多種途徑啟動Aβ誘導(dǎo)的下游反應(yīng)，其中Aβ沉積誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)已成為AD公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制之一[4]。因此了解Aβ生成和清除機(jī)制及神經(jīng)炎癥水平，對尋找潛在的AD防治策略至關(guān)重要。

杜仲系杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，京尼平苷酸(Geniposidic acid, GPA)是杜仲環(huán)烯醚萜類乙醇提取化合物[5]。大量研究顯示，杜仲干燥樹皮的水提物可在細(xì)胞水平有效保護(hù)PC-12細(xì)胞、BV-2細(xì)胞及SH-SY5Y細(xì)胞免受Aβ誘導(dǎo)的損傷并減少細(xì)胞凋亡[6-8]；在動物水平，本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，京尼平苷酸可改善D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導(dǎo)的癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[9]?；诰┠崞杰账峋哂幸种蒲装Y及神經(jīng)保護(hù)的作用，本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，圍繞Aβ沉積和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，以期為京尼平苷酸治療AD奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6～7月齡C57BL/6 J遺傳背景的APP/PS1((APPswe，SEN1dE9)85Dbo)小鼠60只及同月齡的C57BL/6 J小鼠12只，體質(zhì)量23～27 g，購于南京大學(xué)模式動物研究所(批號：D000268)。動物隨機(jī)分組后飼養(yǎng)于溫度(22 ± 2)°C，濕度45%～55%的環(huán)境中，自由進(jìn)水、攝食，定期更換墊料。所有實(shí)驗(yàn)動物操作均符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則相關(guān)政策。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及主要試劑

京尼平苷酸(四川省維克奇生物科技有限公司)；鹽酸多奈哌齊片(衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司)；硫黃素-T(美國Sigma公司)；DAB 顯色試劑盒(丹麥 Dako公司)；防熒光猝滅劑(美國Vector公司)；白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；IDE兔多克隆抗體(Millipore公司)；BACE小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔 lgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器

DMS-2型Morris 水迷宮，DTT-2 型小鼠跳臺儀，SBA-2型小鼠避暗儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；RM2245型切片機(jī)(德國萊卡公司)；DB-09 型石蠟包埋機(jī)(湖北德森科技有限公司)；YABO 200 型漂烘片機(jī)(常州市雅博電子設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(美國 Thermo 公司)；DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀，電轉(zhuǎn)儀(美國 BIO-RAD 公司)；低溫冷凍離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；超純制水機(jī)(成都唐氏唐寧科技發(fā)展有限公司)；PY-120 水平脫色搖床(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)；超低溫冰箱(美國 Thermo 公司)；UVP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國 UVP 公司)；萬分之一電子天平(日本 A﹠G 有限公司)；LSM510 型顯微鏡(日本Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組，模型的建立及給藥

6～7月齡APP/PS1小鼠60只，隨機(jī)分成5組，即轉(zhuǎn)基因組、京尼平苷酸組(25 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg)、多奈哌齊(0.75 mg/kg)組，每組12只。同窩野生C57BL/6 J小鼠12只作為野生組。治療組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，同時(shí)野生組和轉(zhuǎn)基因組小鼠根據(jù)體重灌服相應(yīng)體積的生理鹽水，連續(xù)給藥至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

給予測試藥90天后，Morris水迷宮檢測癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)前在水迷宮內(nèi)倒入30 g高分散型二氧化鈦，使池內(nèi)呈奶白色環(huán)境，以便攝像裝置更準(zhǔn)確地記錄小鼠游泳路徑。實(shí)驗(yàn)過程中，水溫保持在(22 ± 2)°C，保持房間光線恒定，環(huán)境安靜。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。前5 d為定位航行實(shí)驗(yàn)，逃避平臺位于水面下約1 cm，平臺設(shè)于固定象限中心，小鼠每天從相鄰象限和相對象限入水，入水緩慢且保持小鼠頭朝池壁，記錄每只小鼠的逃逸潛伏期作為訓(xùn)練成績。若120 s內(nèi)小鼠未能成功找到平臺，則引導(dǎo)其至平臺停留15 s，逃逸潛伏期以120 s計(jì)，休息10 s再從另一象限入水。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，移去平臺，小鼠從選定象限頭朝池壁入水，記錄小鼠120 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)。

1.2.3 硫黃素-T染色

石蠟包埋的腦組織連續(xù)冠狀切片，切片厚3.5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，0.1% 硫黃素-T 50%乙醇染液室溫孵育10 min，70%乙醇脫水、蒸餾水清洗后，通風(fēng)晾干后用防熒光猝滅劑封片，避光保存。熒光顯微鏡下攝取腦組織的皮層區(qū)及海馬區(qū)，評價(jià)京尼平苷酸對APP/PS1小鼠腦組織硫黃素-T陽性斑塊(纖維狀淀粉樣斑塊)沉積的影響。

1.2.4 Western blot 檢測BACE，IDE蛋白表達(dá)

精確稱取一定質(zhì)量的海馬或皮層組織，加入適量RIPA裂解液(含終濃度為1 mmol/L的PMSF)提取總蛋白，蛋白測定儀測定蛋白濃度。蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后室溫封閉一小時(shí)，BACE(1∶500)，IDE(1∶15000)，β-actin(1∶1000)抗體4°C孵育過夜。次日，HRP標(biāo)記的相應(yīng)種屬的二抗(1∶10000)室溫孵育PVDF膜一小時(shí)后，UVP化學(xué)發(fā)光檢測儀對條帶實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行信號收集。

1.2.5 ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α含量

精確稱取一定質(zhì)量的海馬或皮層組織，按照每10 mg組織加入100 μL RIPA蛋白裂解液的比例加入RIPA，同時(shí)加入PMSF使其終濃度為1 mmol/L，制作成10%勻漿。收集組織勻漿上清并用蛋白測定儀測定蛋白濃度。各指標(biāo)測定嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。顯色結(jié)束后，于450 nm處測定O.D.值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各指標(biāo)含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型小鼠比較，轉(zhuǎn)基因小鼠從訓(xùn)練的第三天起潛伏期明顯增加(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)障礙；與轉(zhuǎn)基因比較，GPA 25、75 mg/kg劑量組和多奈哌齊組潛伏期明顯縮短(P<0.05)。空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠穿越平臺次數(shù)明顯少于野生組(P<0.05)，說明癡呆小鼠記憶力顯著下降；與轉(zhuǎn)基因組比較，GPA各組均不同程度增加了癡呆小鼠穿越平臺次數(shù)，其中，GPA75 mg/kg和多奈哌齊組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1、表2)。

Tab.1 Effect of GPA treatment on APP/PS1 double transgenic mice in the probe test

組別劑量/ mg/kg穿越平臺次數(shù)(次)野生組3.42±1.39轉(zhuǎn)基因組1.00±0.58#GPA252.78±1.30502.36±1.24753.09±1.88?多奈哌齊0.753.36±1.50?

注：與野生組比較#P<0.05；與轉(zhuǎn)基因組比較*P<0.05(表2同)。

Tab.2 Effect of GPA treatment on APP/PS1 double transgenic mice in escape latency test

組別劑量/mg/kg第一天/s第二天/s第三天/s第四天/s第五天/s野生組110.89±4.0491.74±6.7873.98±8.4364.56±27.14 53.84±9.47轉(zhuǎn)基因組115.70±5.15111.016±8.34107.01±10.74#104.33±10.61#96.62±12.07#GPA25112.55±4.85105.16±8.14102.78±10.1363.94±10.00?58.37±11.38?50115.26±4.39110.48±7.3790.59±9.1680.60±9.0571.57±10.2975116.47±4.3999.63±7.3790.49±9.1683.70±9.0561.68±10.29?多奈哌齊0.75112.94±4.85104.38±8.14100.84±10.1387.01±10.0060.05±11.38?

2.2 京尼平苷酸對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中硫黃素-T斑塊表達(dá)的影響

皮層和海馬組織各區(qū)Th-T染色結(jié)果顯示，野生型小鼠皮層及海馬區(qū)Th-T綠色熒光斑塊數(shù)量較少。而轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬區(qū)Th-T斑塊密且多，面積較大，亮度較高，Th-T百分面積顯著增多(P<0.01)；與轉(zhuǎn)基因小鼠相比，GPA各劑量組及多奈哌齊組小鼠皮層和海馬各區(qū)Th-T綠色熒光斑塊顯著減少，且亮度明顯降低，Th-T熒光面積百分比顯著降低(P<0.01)(圖1、表3)。

Tab.3 Effect of GPA treatment on the percent area of Th-T marked Aβ positive plaque in APP/PS1 double transgenic mice brain

組別劑量/mg/kg海馬(ROI%)皮層(ROI%)野生組0.63±0.050.48±0.06轉(zhuǎn)基因組2.88±0.34##1.90±0.57##GPA251.73±0.30??1.01±0.14??501.03±0.18??0.63±0.04??751.13±0.22??0.75±0.11??多奈哌齊0.751.32±0.19??0.74±0.08??

注：與野生組比較##P<0.01；與轉(zhuǎn)基因組比較**P<0.01。

2.3 京尼平苷酸對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中BACE，IDE蛋白表達(dá)的影響(圖2)

A：海馬50x； B：皮層200x圖1 京尼平苷酸對APP/PS1小鼠大腦Th-T斑塊的影響Fig.1 Effect of GPA treatment on APP/PS1 double transgenic mice in the of Th-T staining

圖2 京尼平苷酸對APP/PS1小鼠皮層及海馬組織IDE、BACE蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of GPA on the protein expression of BACE and IDE in the cortex and the hippocampus of APP/PS1 double transgenic mice

Western blot 結(jié)果圖2顯示，在皮層組織及海馬組織中，與野生型小鼠比較，轉(zhuǎn)基因小鼠IDE的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，BACE的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與轉(zhuǎn)基因小鼠比較，GPA 25，50，75 mg/kg劑量組及多奈哌齊組IDE的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，BACE的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。

2.4 京尼平苷酸對APP/PS1小鼠腦內(nèi)IL- 1β、 IL-4、IL - 6、TNF-α含量的影響

與野生型小鼠比較，轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著升高，IL-4含量顯著降低(P<0.01)。經(jīng)GPA治療后，轉(zhuǎn)基因小鼠皮層及海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯降低，其中GPA 50，75 mg/kg給藥組及多奈哌齊給藥組小鼠皮層中三者含量顯著降低(P<0.01)，GPA各給藥組及多奈哌齊給藥組小鼠海馬中三者含量明顯降低(P<0.05)，GPA 50 mg/kg組小鼠皮層組織IL-4含量明顯升高(P<0.05)，但對海馬組織內(nèi)IL-4含量只有輕微升高的作用(表4、表5)。

Tab.4 Effect of GPA treatment on APP/PS1 double transgenic mice in the levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-4 in the cortex

組別劑量/mg/kgIL-1β /pg/mgIL-6 /pg/mgTNF-α/pg/mgIL-4/pg/mg野生組35.36±2.0656.19±3.5663.48±6.1537.34±3.56轉(zhuǎn)基因組60.49±7.09##78.45±5.49##136.75±7.50##19.58±2.44##GPA2547.84±3.64?55.74±3.30??71.48±11.67??26.22±4.085037.53±1.56?57.84±3.71??63.73±13.20??31.58±3.79?7539.70±3.33?57.92±0.97??65.06±8.72??28.98±2.78多奈哌齊0.7535.76±3.43??56.84±1.89??76.49±9.92??28.20±2.76

注：與野生組比較##P<0.01；與轉(zhuǎn)基因組比較*P<0.05，**P<0.01(表5同)。

Tab.5 Effect of GPA treatment on APP/PS1 double transgenic mice in the levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-4 in the hippocampus

組別劑量/mg/kgIL-1β/pg/mgIL-6/pg/mgTNF-α/pg/mgIL-4/pg/mg野生組32.58±1.4540.96±1.0724.80±6.8431.72±3.65轉(zhuǎn)基因組42.95±2.19##63.39±3.62##60.57±8.62##17.94±1.55##GPA2538.64±1.34?52.33±6.04?34.72±7.13?22.67±3.275036.22±0.82??49.83±3.64?36.82±6.91?26.03±3.057535.97±1.40??46.09±3.32??34.38±5.34?22.17±2.08多奈哌齊0.7536.17±0.70??47.84±1.28?34.70±8.20?23.35±2.86

3 討論

AD患者具有兩大病理特征：神經(jīng)元外Aβ沉積形成的老年斑(senile plaque, SP)，以及神經(jīng)元內(nèi)由Tau蛋白過度磷酸化和營養(yǎng)不良性神經(jīng)突起形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)[10-11]。具有神經(jīng)毒性的Aβ聚集，尤其是Aβ1-42，是觸發(fā)病理級聯(lián)的關(guān)鍵。β-淀粉樣蛋白的大量沉積可活化星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)，誘發(fā)中樞神經(jīng)炎性反應(yīng)或直接損傷神經(jīng)元，最終導(dǎo)致記憶減退、認(rèn)知障礙和人格改變[12]?？臻g記憶能力與海馬和大腦皮層功能密切相關(guān)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評價(jià)藥物改善AD動物空間記憶及學(xué)習(xí)能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GPA具有改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠很好地模擬了AD患者腦內(nèi)慢性Aβ沉積和炎癥過程，是可靠的AD動物模型[13]。硫磺素-T(Th-T)可以標(biāo)記AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織內(nèi)纖維狀A(yù)β的β-折疊結(jié)構(gòu)，熒光顯微鏡下觀察到的綠色熒光即為Th-T標(biāo)記的Aβ陽性斑塊[14]。本實(shí)驗(yàn)中，Th-T可成功標(biāo)記Tg小鼠腦內(nèi)Aβ沉積，而WT小鼠未檢測到熒光標(biāo)記物，表明APP/PS1小鼠腦內(nèi)存在典型的AD病理改變-Aβ沉積。經(jīng)GPA治療的小鼠皮層及海馬組織內(nèi)Aβ陽性斑塊數(shù)量顯著減少，陽性面積百分比顯著降低，提示GPA可減輕腦組織的病理改變。

Aβ是β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, APP) 在APP 的β-分泌酶和γ-分泌酶水解途徑介導(dǎo)的病理狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物。β-分泌酶(β-site APP cleaved enzyme, BACE1)作為Aβ生成的限制酶，促進(jìn)APP水解成Aβ，間接控制著Aβ 產(chǎn)生[15]。Heneka等研究顯示，APP轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)Aβ沉積之前，腦內(nèi)炎癥部位的BACE1表達(dá)和活性明顯增加，表明炎癥過程可能直接促進(jìn)局部Aβ的產(chǎn)生[16]。體內(nèi)、體外研究均發(fā)現(xiàn)，胰島素降解酶(Insulin-degrading enzyme, IDE)不但參與降解胰島素，還發(fā)揮著降解Aβ的重要作用，是體內(nèi)的Aβ降解酶之一，IDE活性與Aβ聚集程度呈負(fù)相關(guān)[17]。腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌IDE至胞外，參與胞外Aβ的降解[18]。在能降解Aβ的幾種酶中，IDE是唯一已知能降解可溶性和不溶性形Aβ的酶[19]。Farris等發(fā)現(xiàn)，小鼠IDE純合子基因缺失造成IDE功能的完全喪失，會導(dǎo)致3月齡小鼠腦內(nèi)Aβ1-40水平約升高65%[20]。當(dāng)BACE-1活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)Aβ 生成增多，IDE活性減弱，誘導(dǎo)Aβ降解降解機(jī)制發(fā)生障礙，易導(dǎo)致Aβ 團(tuán)簇狀聚集，沉積在腦內(nèi)引起炎癥等反應(yīng)，造成神經(jīng)元丟失和突觸傳導(dǎo)障礙。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，京尼平苷酸干預(yù)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠3個(gè)月后，小鼠皮層及海馬區(qū)BACE1蛋白表達(dá)顯著降低，IDE蛋白水平顯著升高，提示京尼平苷酸可通過影響Aβ的生成和降解兩方面調(diào)控小鼠腦內(nèi)Aβ水平。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測到，與Tg小鼠相比，經(jīng)京尼平苷酸治療的APP/PS1小鼠皮層及海馬區(qū)炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)表達(dá)顯著降低，IL-4的表達(dá)有所增加，提示京尼平苷酸可減輕轉(zhuǎn)基因AD小鼠的神經(jīng)炎癥，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究提示京尼平苷酸可通過降低BACE活性同時(shí)增加IDE活性，減少APP剪切成具有神經(jīng)毒性的Aβ的同時(shí)增加Aβ的降解，干預(yù)炎癥因子釋放，此過程以正反饋發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。