外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響

馮玉龍，邢嘉怡，劉慧英，崔金霞，徐巍，張碩

(1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832000)

近年來(lái)，土壤次生鹽漬化嚴(yán)重限制了保護(hù)地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展。鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成許多不利影響，其引起滲透脅迫、離子毒害和營(yíng)養(yǎng)失衡，使根系活力下降，生長(zhǎng)受抑[1]。耕作土層次生鹽漬化通過(guò)破壞清除活性氧(ROS)的抗氧化系統(tǒng)，使得內(nèi)源活性氧(H2O2,O2·-)水平提高，破壞細(xì)胞膜蛋白質(zhì)磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞內(nèi)代謝不能有序的進(jìn)行，從而導(dǎo)致植物生理過(guò)程受阻，嚴(yán)重限制植株的生長(zhǎng)[3]。因此，如何緩解鹽脅迫和增強(qiáng)植物的抗鹽性，已成為設(shè)施生產(chǎn)的重要問(wèn)題。

過(guò)氧化氫 (Hydrogen peroxide,H2O2) 是植物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，以 H2O2為中心的 ROS爆發(fā)是動(dòng)植物對(duì)外界生物與非生物脅迫響應(yīng)的普遍特征[4-6]。H2O2對(duì)植物具有雙重作用，一方面H2O2可以作為信號(hào)分子通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)來(lái)誘導(dǎo)植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程、參與對(duì)環(huán)境適應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，另一方面高濃度H2O2具有強(qiáng)氧化性，從而對(duì)植物產(chǎn)生氧化脅迫作用。H2O2對(duì)植物的具體表現(xiàn)因施用的濃度和部位以及植物細(xì)胞的具體生理?xiàng)l件不同而不同。研究[7-9]發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2預(yù)處理能夠打破種子休眠,促進(jìn)種子萌發(fā),提高抗氧化酶活性,降低膜脂過(guò)氧化程度,緩解葉綠體膜的傷害,從而增強(qiáng)黃瓜[7]、燕麥[8]和玉米[9]幼苗的耐鹽性。此外,H2O2作為第二信使在細(xì)胞程序性死亡[10]、配體與受體的相互作用、保護(hù)酶系統(tǒng)的激活、基因的表達(dá)和誘導(dǎo)植物抗病性等過(guò)程中起到不可缺少的作用[11]。

近年來(lái),已有許多H2O2參與生物和非生物脅迫防御應(yīng)答的研究，但目前H2O2對(duì)于調(diào)控植物鹽適應(yīng)的作用依然十分有限。因此,本文以番茄“中蔬四號(hào)”的幼苗為材料，采用藥理學(xué)手段，通過(guò)對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗葉片外源分別施用H2O2和二甲基硫脲(dimethylthiourea,DMTU。一種H2O2的淬滅劑)來(lái)調(diào)控內(nèi)源H2O2水平，研究H2O2對(duì)鹽脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)及生理特性的影響，為進(jìn)一步闡明番茄耐鹽性形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與測(cè)量指標(biāo)的方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用番茄(LycopersiconesculentumMill.)品種“中蔬四號(hào)”作為供試材料。試驗(yàn)材料于2017～2018年在石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站日光溫室內(nèi)種植與進(jìn)行處理。番茄種子溫湯浸種、催芽露白后播種于含有草炭和蛭石(1∶1,V/V))基質(zhì)的72孔穴盤(pán)中育苗，培養(yǎng)幼苗至兩葉一心時(shí)，挑選生長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯幼苗移入有苯板覆蓋的12 L水桶中，裝入10 L營(yíng)養(yǎng)液(pH 6.2)。待7 d幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理。

試驗(yàn)設(shè)置以下5個(gè)處理:(1)不噴施H2O2且不加NaCl，葉片噴施蒸餾水(CK)；(2)加入100 mmol/L NaCl和葉面噴施蒸餾水(NaCl)；(3)添加100 mmol/L NaCl和葉片噴施5 mmol/L DMTU (D)；(4)添加100 mmol/L NaCI和葉片噴施0.01 mmol/L H2O2(H)；(5)添加100 mmol/L NaCI和葉片噴施0.01 mmol/L H2O2+5 mmol/L DMTU(HD)。

NaCl、DMTU和H2O2的施用濃度均為課題組前期試驗(yàn)篩選所得。

試驗(yàn)期間，NaCl先用水溶解后加入種植桶中，模擬設(shè)施耕作層土壤鹽漬化環(huán)境；外源H2O2和 DMTU裝入錫箔紙遮光包裹的250 mL的藥壺中于每日9:30噴灑于番茄幼苗葉片上下部。

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3桶/處理，4株/桶，于處理第6 d取樣并測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

分別取第6 d各處理內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)一致的植株參考周艷[12]的方法測(cè)定株高、莖粗、干重、鮮重。

1.2.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

用TTC法[13]測(cè)定根系活力；電導(dǎo)法測(cè)定電解質(zhì)滲透率；茚三酮比色法[14]測(cè)定脯氨酸含量；硫代巴比妥酸法[15]測(cè)定MDA含量；參照張憲政的方法[16]測(cè)定葉綠素含量；參照Rao and Sresty[17]的方法測(cè)定SOD活性，POD和CAT活性測(cè)定參照Z(yǔ)hang的方法[18]。

1.3 數(shù)據(jù)的整理與分析

使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和多重比較的分析，最后將統(tǒng)計(jì)和分析的數(shù)據(jù)結(jié)果用WPS 2019和Origin 9.0做成所需的表格和圖片，表、圖中的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

由表1可知：與CK相比，NaCl處理顯著抑制了番茄幼苗的株高、莖粗、地上及地下部鮮重和干重；與NaCl處理相比，D和H處理均顯著提高了番茄幼苗的株高、地上及地下部鮮重和干重，且H處理的株高、地上及地下部鮮重和干重顯著高于D處理。2個(gè)處理對(duì)幼苗的莖粗無(wú)顯著影響；與H處理相比，HD處理下幼苗的株高、地上部鮮重和干重和地下部干重均顯著降低，而莖粗和地下部鮮重?zé)o顯著變化。

表1 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of exogenous H2O2on the morphological indexes of tomato seedlings under NaCl stress

注:小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平顯著性差異。

圖1顯示：與CK相比，番茄幼苗的根系活力在NaCl處理下顯著降低了47%；與NaCl處理相比，D、H、HD 3個(gè)處理下番茄幼苗的根系活力分別提高了5%、25%和10%，但均顯著低于CK。H處理的根系活力顯著高于D處理的，而HD處理的根系活力顯著低于H處理的。

圖1 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下番茄幼苗根系活力的影響Fig.1 Effect of exogenous H2O2 on the root activity of tomato seedlings under NaCl stress

2.2 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b的影響

結(jié)果(表2)顯示：NaCl處理較CK顯著降低了番茄幼苗的光合色素Chla和Chlb的含量；與NaCl處理相比，D、H、HD 3個(gè)處理均顯著提高了番茄幼苗Chla和Chlb的含量，其中H處理的Chla和Chlb的含量顯著高于D和HD處理的，HD處理的Chla的含量和Chlb的含量分別顯著高于和低于D處理的。

2.3 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗電解質(zhì)滲透率和細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的影響

由結(jié)果(表3)可知：NaCl處理下番茄幼苗葉片的電解質(zhì)滲透率和MDA含量分別較CK提高了4倍和1.4倍；與NaCl處理相比，D、H、HD 3個(gè)處理下的電解質(zhì)滲透率和MDA含量均顯著降低，但3個(gè)處理均顯著高于CK。H處理的電解質(zhì)滲透率和MDA含量均顯著低于D處理，D處理顯著低于HD處理的。

表2 外源H2O2對(duì)NaCI脅迫下番茄幼苗 葉片葉綠素a和葉綠素b的影響Tab.2 Effect of exogenous H2O2 on the Chla and Chlb content in leaves of tomato seedlings under NaCl stress

注:小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平顯著性差異。

表3 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下番茄幼苗葉片電解質(zhì) 滲透率和丙二醛(MDA)含量的影響Tab.3 Effect of exogenous H2O2 on the electrolytic leakage and MDA content in leaves of tomato seeding under NaCl stress

注:小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平顯著性差異。

2.4 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄葉片脯氨酸(Pro)含量的影響

由結(jié)果(圖2)可知：與CK相比，NaCl處理使番茄葉片中Pro含量顯著增加；與NaCl處理相比，D、H、HD 3個(gè)處理下番茄葉片的Pro含量均顯著增加。H處理番茄葉片的Pro含量顯著高于D與HD處理，D與HD處理間無(wú)顯著差異。

圖2 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下番茄幼苗葉片Pro含量的影響Fig.2 Effect of exogenous H2O2 on the contents of proline in leaves of tomato seedlings under NaCl stress

2.5 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗葉片H2O2含量的影響

結(jié)果(圖3)顯示：與CK相比，NaCl脅迫處理顯著提高了番茄幼苗葉片中H2O2含量;與NaCl處理相比，D、H、HD 3個(gè)處理下的H2O2含量均顯著降低。H處理番茄葉片的H2O2含量顯著高于D與HD處理，HD顯著低于D處理的。

圖3 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下番茄幼苗H2O2含量的影響Fig.3 Effect of exogenous H2O2 on the contents of H2O2 in leaves of tomato seedlings under NaCl stress

2.6 外源H2O2對(duì)NaCl脅迫下番茄幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由結(jié)果(表4)可知：同CK相比，NaCl脅迫處理可使番茄幼苗葉片中SOD、POD和CAT 3種抗氧化酶的活性顯著下降；H和D處理下番茄幼苗葉片中3種抗氧化酶的活性均顯著提高，且H處理下SOD和POD抗氧化酶的活性均顯著低于于D處理，CAT顯著高于D處理；與H處理相比，HD處理下番茄葉片中SOD和POD活性顯著降低，而CAT活性顯著提高。

表4 外源H2O2對(duì)鹽脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響Tab.4 Effect of exogenous H2O2 on antioxidant enzyme activities of tomato seedling under salt stress

3 討論

(1)H2O2是植物體內(nèi)一種重要的ROS，高濃度H2O2對(duì)植物產(chǎn)生傷害，而H2O2在低濃度作為信號(hào)分子，參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[19-22]。本文研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下顯著增加了內(nèi)源H2O2水平，高水平內(nèi)源H2O2顯著抑制了番茄幼苗的生長(zhǎng)和降低了番茄幼苗光合色素的含量。而鹽脅迫下葉面噴施H2O2(H處理)和DMTU(D處理)均能不同程度顯著降低內(nèi)源H2O2水平，提高番茄幼苗的株高、地上、地下部干鮮重和根系活力和光合色素含量，說(shuō)明外源噴施H2O2和DMTU均能通過(guò)降低內(nèi)源H2O2水平而緩解NaCl脅迫對(duì)加工番茄幼苗生長(zhǎng)的抑制作用和提高幼苗鹽適應(yīng)性。而噴施 H2O2緩解NaCl脅迫的效果優(yōu)于噴施DMTU的，這與NaCl脅迫下噴施 H2O2的番茄幼苗葉片內(nèi)源H2O2水平高于噴施DMTU的相一致(表1、表2、表3和圖1)，表明植物體內(nèi)維持一定較高水平的H2O2有利于提高番茄的鹽適應(yīng)性。

前人研究發(fā)現(xiàn)外源低濃度的H2O2顯著減輕了小麥[23]和煙草[24]膜脂過(guò)氧化程度，增加了Pro含量，增強(qiáng)了植物抗鹽性。本文研究亦表明葉面噴施H2O2和DMTU均能顯著降低鹽脅迫下番茄幼苗電解質(zhì)滲透率和MDA含量和顯著提高了脯氨酸含量(表3 和圖2)，說(shuō)明通過(guò)藥理學(xué)手段降低內(nèi)源H2O2水平能有效降低NaCl脅迫下番茄幼苗膜脂過(guò)氧化程度，并誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)，從而緩解NaCl脅迫傷害，從而增強(qiáng)番茄幼苗的抗逆性。另外，3個(gè)分別外源噴施H2O2、DMTU和H2O2+DMTU處理下的內(nèi)源H2O2水平與緩解鹽脅迫的效果相一致，其中以NaCl脅迫下噴施 0.01 mmol/L H2O2的緩解效果最好。

(2)植物體有氧代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量ROS，微量的ROS作為信號(hào)分子在調(diào)節(jié)植物的生理過(guò)程和參與調(diào)控脅迫反應(yīng)中扮有重要的角色[25]。鹽脅迫會(huì)使植物體內(nèi)積累大量ROS(H2O2，O2·-，OH-等)，從而導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)失去平衡[26]。正常生長(zhǎng)情況下植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)在清除ROS氧化損傷中扮有重要的角色。SOD能催化O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2和O2，H2O2隨后主要被POD、CAT和AsA -GSH循環(huán)清除。

本文研究表明，NaCl脅迫顯著提高了H2O2含量，降低了SOD、POD、CAT三種酶活性，低活性的酶導(dǎo)致ROS的大量積累，從而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，最終使膜系統(tǒng)變性[27]。而葉面噴施H2O2和DMTU均顯著提高了NaCl脅迫下SOD、POD、CAT三種酶的活性，其中外源H2O2誘導(dǎo)POD活性提高效果顯著、而外源DMTU誘導(dǎo)SOD和CAT活性提高顯著；葉面噴施H2O2+DMTU的處理顯著提高了CAT活性，但降低了SOD和POD活性。說(shuō)明NaCl脅迫破壞了番茄ROS清除系統(tǒng)，而外源噴施適宜濃度H2O2和DMTU能誘導(dǎo)不同的抗氧化酶活性清除ROS，從而有效增強(qiáng)番茄幼苗的抗(耐)鹽性。

3 結(jié)論

將適宜濃度的H2O2(0.01 mmol/L)和DMTU(5 mmol/L)噴灑在NaCl脅迫番茄幼苗上，可以增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力，提高其氧化酶活性，并使植物體內(nèi)的H2O2水平下降，過(guò)氧化反應(yīng)減弱，氧化脅迫減輕，脂膜過(guò)氧化程度下降，從而起到保護(hù)作用，緩解NaCl脅迫帶來(lái)的抑制效果，提高幼苗適應(yīng)能力，增強(qiáng)幼苗抗鹽性，且以0.01 mmol/L H2O2施用的緩解NaCl的效果最為顯著。