中藥復(fù)方健宮散對子宮炎奶牛免疫功能的影響

張保軍，喬彥杰，梁小瑞，王丹陽，劉賢俠，谷新利

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，繁殖障礙問題越來越突顯，不孕癥已成為世界三大流行病之一[1]。子宮炎是引起不孕癥的主要原因之一[2]，該病常引起子宮復(fù)舊不全，卵泡發(fā)育異常，使奶牛繁殖力和產(chǎn)奶量下降，給奶牛養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失。奶牛產(chǎn)后由于受到產(chǎn)犢和泌乳等應(yīng)激因素的影響，容易導(dǎo)致免疫機能下降，子宮受到感染引發(fā)子宮炎[3]。子宮受到細菌感染后，機體通過非特異性免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)進行免疫防御。免疫球蛋白(Ig)是黏膜免疫和體液免疫中發(fā)揮重要防御功能的蛋白質(zhì)，在抗子宮感染過程中發(fā)揮著重要作用[4]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)是T淋巴細胞分泌并參與細胞免疫的細胞因子。Gilmansachs[5]發(fā)現(xiàn)高濃度的TNF-α和IFN-γ能加速炎癥的發(fā)展，影響胚胎的著床，對妊娠產(chǎn)生負面影響。有學(xué)者推測，細胞免疫功能障礙與亞臨床子宮內(nèi)膜炎并存可能是導(dǎo)致晚期子宮炎癥的主要原因[6]。

目前，治療奶牛子宮炎多選用抗生素療法，重復(fù)大量的使用抗生素容易引發(fā)細菌耐藥性，引起機體抵抗力下降或菌群紊亂，導(dǎo)致其他疾病[7]。中草藥具有安全無毒且不易引發(fā)細菌耐藥性等優(yōu)點，在治療疾病上越來越受到人們的青睞。近年來，許多中草藥及其提取物已顯示出積極的治療作用，包括抑菌、抗炎和抗癌等[8]。本研究通過檢測中藥健宮散治療奶牛子宮炎前后血清中Ig G、Ig M和IFN-γ、TNF-α 4種免疫學(xué)指標含量的變化情況，探討中藥健宮散對子宮炎奶牛免疫功能的影響，為今后健宮散的深度開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，提升中草藥服務(wù)于現(xiàn)代奶牛產(chǎn)業(yè)的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

B超儀(型號HS-101 V)，配備直腸線陣變頻探頭，掃查深度6～24 cm；Power Wave XS2 Bio Tek?酶標儀(型號ELx800)；離心機(型號H1850R)，購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；微量快速震蕩儀(型號QB-9002 Kylin-Bell)，購自Lab Instruments公司；微孔板脫水儀(型號BIOS-401)，購自BIOSCIENCE梅奧賽斯(天津)生物科技有限公司。

1.1.2 藥品與試劑

健宮散(散劑，400 g/袋)，由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)研究室研制而成，由益母草、當歸、川芎、五靈脂、桃仁、甘草等中藥組成，方中各藥材均購自當?shù)厮幍辍?/p>

牛血清Ig G(批號：E11I0058)、Ig M(批號：E11I0038)、IFN-γ(批號：E11I0345)和TNF-α(批號：E11T0008)ELISA檢測試劑盒均購自上海Blue Gene生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀、陰道分泌物性狀判斷子宮炎的標準

臨床上出現(xiàn)體溫高于39.5 ℃，呼吸速率加快，精神萎靡，食欲不振，反芻減少等癥狀；努責(zé)、拱腰、舉尾時從陰道流出大量污濁或棕黃色黏液膿性分泌物，有腥臭味，內(nèi)含絮狀物或胎衣碎片，常附著尾根，形成干痂的則為子宮奶牛；否則為正常健康奶牛。

1.2.2 B超檢查判斷子宮炎的標準

B超檢查時若子宮角變粗，子宮壁增厚；子宮內(nèi)蓄積白色或灰黃色滲出物，觸之有明顯的波動感，則判定為子宮炎奶牛，否則為正常健康奶牛。

1.2.3 試驗動物與分組

在新疆石河子西部牧業(yè)優(yōu)良種畜繁育中心奶牛場選擇年齡、胎次、產(chǎn)奶量相近，飼養(yǎng)條件一致，無傳染病及寄生蟲病的中國荷斯坦奶牛18頭。根據(jù)臨床癥狀、陰道分泌物性狀及B超檢查結(jié)果，共診斷出健康奶牛6頭作為正常組；子宮炎奶牛12頭，其中6頭進行中藥治療作為治療組；另外6頭不進行治療，作為患病組，記錄所有供試奶牛的產(chǎn)犢日期。

1.2.4 投藥及采血

治療組奶牛每頭每天灌服健宮散400 g，每天1次，連續(xù)灌服1個療程(7 d)，正常組和患病組不進行任何處理。治療組奶牛灌服健宮散前采血1次，用藥中期(即第3天用藥)采血1次，灌藥結(jié)束后第1、4、7、11、15、20天每天采血1次，共采血8次，采血時間為14:00—16:00，正常組、患病組在同時間采血，采血次數(shù)同治療組。

1.2.5 樣品的采集

清晨空腹尾靜脈采取血液5 mL，室溫靜置自然析出血清，裝于1.5 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱中，待檢。

1.2.6 指標的測定

Ig G、Ig M、TNF-α和IFN-γ含量測定均采用ELISA法，按照說明書在酶標儀上操作進行，分別在450 nm條件下讀取OD值并制作標準曲線，根據(jù)曲線方程求得血清含量值。

1.2.7 療效判定

用藥1～3個療程后，在45 d內(nèi)出現(xiàn)發(fā)情癥狀、并排卵者記為有效，懷孕受胎者記為治愈，用藥后不發(fā)情也不排卵受孕者記為無效。

1.2.8 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS l7.0軟件對數(shù)據(jù)單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 健宮散對奶牛子宮炎的治療效果

健宮散對奶牛子宮炎的治療效果結(jié)果見表1。

表1 健宮散治療奶牛子宮炎的療效情況Tab.1 Curative effect of Jiangong powder on dairy cows with uteritis

2.2 中藥健宮散治療奶牛子宮炎對血清Ig G含量的影響

由表2可知，用藥前，治療組血清Ig G含量與患病組相比差異不顯著(P>0.05)，極顯著低于正常組(P<0.01)；用藥中，治療組血清Ig G含量顯著高于患病組(P<0.05)，相比正常組差異極顯著(P<0.01)；用藥后第1天，治療組極顯著低于正常組(P<0.01)，用藥后的第1天之后其含量逐漸升高，隨著用藥時間的延長，免疫調(diào)節(jié)的變化，基本達到正常水平，且差異不顯著(P>0.05)，相比患病組差異極顯著(P<0.01)；患病組用藥前后整體變化幅度不大，各時間點與正常組比較差異極顯著(P<0.01)。

表2 血清Ig G含量測定結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)肩標大小寫字母均不相同表示各組組間比較差異極顯著(P<0.01)；大寫字母相同小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；字母完全相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.3 中藥健宮散治療奶牛子宮炎對血清Ig M含量的影響

由表3可知，用藥前和用藥中，治療組和患病組血清Ig M含量均顯著低于正常組(P<0.01)，治療組與患病組Ig M含量差異不顯著(P>0.05)；經(jīng)健宮散治療后，治療組Ig M含量呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢，在用藥后的第4天之后，其含量極顯著高于患病組(P<0.01)，結(jié)束用藥后治療組Ig M含量恢復(fù)到正常水平，其變化規(guī)律與正常組相似；患病組血清Ig M含量在用藥后第1天和第4天相比正常組差異不顯著(P>0.05)，用藥后的第4天之后與正常組差異極顯著(P<0.01)，整體呈現(xiàn)先快速下降后緩慢升高的變化趨勢。

表3 血清Ig M含量測定結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)肩標大小寫字母均不相同表示各組組間比較差異極顯著(P<0.01)；大寫字母相同小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；字母完全相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.4 中藥健宮散治療奶牛子宮炎對血清IFN-γ含量的影響

由表4可知，用藥前、用藥中和用藥后第1天，治療組和患病組血清IFN-γ含量均極顯著高于正常組(P<0.01)，治療組與患病組差異不顯著(P>0.05)；用藥后第4天，治療組IFN-γ含量顯著低于患病組(P<0.05)，患病組顯著高于正常組(P<0.05)；第4天之后，患病組IFN-γ含量先升高再降低呈波動變化，相比治療組差異極顯著(P<0.01)，與正常組比較差異極顯著(P<0.01)；治療組IFN-γ含量在用藥后逐漸下降，用藥后的第1天之后，其水平略高于正常組，但相比正常組差異不顯著(P>0.05)，用藥后第20天恢復(fù)正常水平。

表4 血清IFN-γ含量測定結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)肩標大小寫字母均不相同表示各組組間比較差異極顯著(P<0.01)；大寫字母相同小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；字母完全相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.5 中藥健宮散治療奶牛子宮炎對血清TNF-α含量的影響

由表5可知，用藥前、用藥中和用藥后第1天，治療組和患病組血清TNF-α含量均顯著高于正常組(P>0.05)，治療組與患病組差異不顯著(P>0.05)；健宮散治療后，含量開始降低，用藥后第4天，治療組TNF-α含量顯著低于患病組(P>0.05)，與正常組比較差異極顯著(P<0.01)；用藥后的第4天之后，治療組極顯著高于患病組(P<0.01)，并逐步達到正常水平，其變化規(guī)律與正常組相符且差異不顯著(P>0.05)；患病組TNF-α含量在用藥后的第1天之后先升高后降低呈波動變化且前后變化幅度差異較大，相比正常組差異極顯著(P<0.01)。

表5 血清TNF-α含量測定結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)肩標大小寫字母均不相同表示各組組間比較差異極顯著(P<0.01)；大寫字母相同小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；字母完全相同表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 健宮散治療前后血清中Ig G和Ig M含量的變化

Ig廣泛分布于動物外周血液、淋巴液和組織分泌液中，包括Ig M、Ig A、Ig E、Ig G等多個類型，主要由B淋巴細胞產(chǎn)生，參與子宮局部免疫和體液免疫。研究發(fā)現(xiàn)，子宮分泌物和血液中同時存在Ig的所有類型，子宮分泌物中以Ig G和Ig A為主，Ig M較少，血液中則以Ig G、Ig M為主[9]。有報道稱[10-11]，Ig濃度的變化可反映子宮的免疫狀態(tài)。劉文[12]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后7天患子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中Ig G含量極顯著高于健康奶牛。Herr等[13]研究了圍產(chǎn)期奶牛免疫狀態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)血清中Ig G和Ig M水平分別在產(chǎn)后第4周和第8周顯著下降，在產(chǎn)犢時達到最低值。產(chǎn)后第4周時，Ig G恢復(fù)到正常水平，而Ig M濃度仍較低，Ig G的減少與初乳中Ig G的濃度有關(guān)。那立冬等[14]對產(chǎn)后21天～42天子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中免疫球蛋白質(zhì)量濃度的變化趨勢進行研究，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中Ig G先降低后升高，而Ig M持續(xù)降低，Ig G和Ig M分別在體液免疫和子宮局部免疫中發(fā)揮作用。李德軍[15]研究了產(chǎn)后7天～49天奶牛臨床型子宮內(nèi)膜炎和隱性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)臨床型子宮內(nèi)膜炎組和隱性子宮內(nèi)膜炎組奶牛血清中Ig G濃度均呈升高趨勢，且極顯著低于健康對照組(P<0.01)；臨床型子宮內(nèi)膜炎組奶牛血清中Ig M濃度極顯著低于健康對照組(P<0.01)，隱性子宮內(nèi)膜炎組奶牛血清中Ig M濃度產(chǎn)后7天后有所下降，之后開始升高，在產(chǎn)后42天時高于健康對照組，與對照組差異不顯著(P>0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)，用藥前治療組和患病組Ig G和Ig M含量顯著低于正常組，在用藥后的第1天之后治療組Ig G和Ig M恢復(fù)正常水平，總體變化規(guī)律與正常組相似。患病組Ig M含量在用藥后的第4天之后極顯著低于正常組，而Ig G含量用藥前后始終極顯著低于正常組，患病組奶牛血清中Ig G在停藥后第4天出現(xiàn)低谷值，之后有回升的趨勢，這與李得軍[15]報道的結(jié)果相似。患病組奶牛血清中Ig M先降低，用藥后第7天出現(xiàn)低谷值，之后開始回升，前后變化幅度相同。這與李得軍[15]和那立冬[14]等研究的結(jié)果一致。

張春剛等[16]研究發(fā)現(xiàn)，由益母草、黃芪等組成的中草藥添加劑可提高奶牛血清Ig M和Ig G的含量。賈斌等[17]也研究發(fā)現(xiàn)，中草藥添加劑(由益母草、當歸、陳皮等組成)能顯著提高奶牛血清Ig G和Ig M含量。李清艷等[18]利用中藥宮炎散(由當歸、甘草等組成)治療奶牛子宮內(nèi)膜炎，發(fā)現(xiàn)宮炎散可顯著提高子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中Ig G的含量。郭亞男等[19]研究發(fā)現(xiàn)由益母草、當歸、黃芪等藥材自制而成的復(fù)方中草藥片劑能顯著提高產(chǎn)后奶牛血清Ig G和Ig M的含量。本試驗可見，治療組奶牛血清中Ig G和Ig M含量分別在用藥后第1天和用藥后的第4天之后極顯著高于患病組，說明健宮散能調(diào)節(jié)Ig G和Ig M的分泌，提高Ig G和Ig M的含量，原因可能是健宮散中益母草、當歸、甘草調(diào)節(jié)Ig G和Ig M的分泌，使得Ig G和Ig M的含量升高。

3.2 健宮散治療前后血清中IFN-γ含量的變化

IFN-γ是一種促炎性細胞因子，主要由活化的Th1細胞產(chǎn)生，可抑制Th2型細胞因子的產(chǎn)生[20]。參與細胞免疫調(diào)節(jié)，促進TNF-α的分泌，抑制體液免疫功能，刺激NK細胞增強其細胞毒性功能，在機體免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。韓莉莉等[21]研究發(fā)現(xiàn)宮頸炎患者血清中IFN-γ的水平均隨著病變嚴重程度的增加而減少。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)慢性子宮內(nèi)膜炎不孕婦女IFN-γ mRNA的表達顯著高于正常組。Mollo等[23]探討了子宮內(nèi)膜息肉患者血清和子宮內(nèi)膜活檢組織中IFN-γ的水平，發(fā)現(xiàn)IFN-γ在子宮內(nèi)膜息肉患者血清和組織活檢中均顯著升高。本試驗中，用藥前治療組和患病組血清IFN-γ含量顯著高于正常組，治療組IFN-γ含量在用藥后的第1天之后與正常組差異不顯著，而患病組IFN-γ含量用藥前后始終極顯著高于正常組，用藥后患病組IFN-γ含量緩慢升高，用藥后第7天出現(xiàn)峰值，隨即下降，前后變化幅度相同。這可能是炎癥前期體液免疫占主導(dǎo)地位，IFN-γ含量升高抑制體液免疫的進行，后期各促炎細胞因子間相互拮抗或協(xié)同作用，中性粒細胞和單核巨噬細胞吞噬作用增強，再加之子宮本身的固有免疫力，因此出現(xiàn)IFN-γ下降的趨勢。

研究發(fā)現(xiàn)，益母草中的多糖成分能顯著提高小鼠血清IFN-γ的含量水平[24]。袁穎等[25]也發(fā)現(xiàn)當歸與黃芪配伍后可增加氣道變應(yīng)性炎癥大鼠血清中IFN-γ的含量從而抑制炎癥反應(yīng)。甘草酸是甘草中重要的活性成分之一，通過與淋巴細胞受體結(jié)合，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IFN-γ發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[26]。呂小華[27]研究表明，甘草和甘草酸能顯著提高小鼠血清IFN-γ的含量(P<0.05)。本試驗中，治療組IFN-γ含量在用藥后的第4天之后極顯著低于患病組。說明健宮散降低了IFN-γ的含量，原因可能是健宮散中益母草、當歸多糖、甘草酸等共同調(diào)節(jié)了IFN-γ的表達，促使子宮炎奶牛血清中IFN-γ的含量降低。

3.3 健宮散治療前后血清中TNF-α含量的變化

TNF-α是炎性細胞因子，可誘導(dǎo)細胞凋亡，引起發(fā)熱等全身癥狀，通過刺激單核細胞和巨噬細胞生成與釋放IL-1和IL-8，導(dǎo)致炎癥進一步發(fā)展擴大[28]。有研究顯示，適量的TNF-α是免疫防御的關(guān)鍵，而過量TNF-α能引起機體炎性損傷，加重炎癥程度[29]。Galv?o等[30]研究了產(chǎn)后早期發(fā)生子宮內(nèi)膜炎奶牛TNF-α基因表達水平，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮中TNF-α基因表達在分娩和產(chǎn)后第1周均低于健康對照奶牛，而第5周后表達顯著提高。Brodzki等[31]發(fā)現(xiàn)患亞臨床型子宮內(nèi)膜炎奶牛血清TNF-α表達水平在產(chǎn)后22 d極顯著高于健康組，產(chǎn)后40 d顯著高于健康組；患子宮內(nèi)膜炎奶牛TNF-α表達水平在產(chǎn)后40天低于健康奶牛。Kim等[32]研究發(fā)現(xiàn)臨床型子宮內(nèi)膜炎奶牛血清TNF-α水平顯著高于亞臨床型子宮內(nèi)膜炎奶牛和正常健康奶牛。Ghasemi等[33]發(fā)現(xiàn)亞臨床子宮內(nèi)膜炎奶牛TNF-α mRNA表達水平提高了20倍。胡路鋒[34]對產(chǎn)后1～35天子宮炎奶牛血清中TNF-α濃度進行檢測，發(fā)現(xiàn)子宮炎組奶牛血清中TNF-α濃度逐漸升高，持續(xù)下降后緩慢升高恢復(fù)正常，整體上呈升高趨勢，且子宮炎組奶牛TNF-α濃度始終低于正常組。付才等[35]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后45天患子宮內(nèi)膜炎奶牛血清中TNF-α含量高于正常健康奶牛。本試驗可見，用藥前治療組和患病組血清TNF-α含量顯著高于正常組，在用藥后的第4天之后相比正常組差異不顯著，總體變化規(guī)律與正常組相似；患病組TNF-α含量在用藥后的第1天之后極顯著高于正常組。其含量變化呈先升高后緩慢降低至用藥前的狀態(tài)，前后變化幅度不大。這與上述研究報道的結(jié)果一致。

益母草常用于治療產(chǎn)科疾病，研究表明，益母草能顯著降低產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎大鼠血清TNF-α的含量[36]。楊興斌等[37]研究表明，當歸多糖通過與巨噬細胞結(jié)合促進TNF-α的分泌。凌婧等[38]報道，川芎油通過降低大鼠血漿中TNF-α的含量以減少由于損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。申保生等[39]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方甘草酸苷能顯著降低肝炎患者血清TNF-α的含量(P<0.05)。在復(fù)方組成上，李清艷等[18]利用中藥宮炎散(由當歸、甘草等組成)治療奶牛子宮內(nèi)膜炎，發(fā)現(xiàn)宮炎散能降低子宮內(nèi)膜炎奶牛血清TNF-α的含量。彭津津等[40]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)宮散(由益母草、當歸、川芎、桃仁、紅花、赤芍等多種藥材組成)能顯著降低子宮內(nèi)膜炎模型家兔血液中TNF-α的含量(P<0.05)。賈書紅等[41]研究發(fā)現(xiàn)，由益母草、當歸、川芎、桃仁、五靈脂、甘草等組成的中藥復(fù)方宮炎凈中生物堿能顯著降低子宮內(nèi)膜炎家兔血清中TNF-α的含量(P<0.05)。本試驗可見，治療組TNF-α含量在用藥后的第4天之后極顯著低于患病組，且經(jīng)健宮散治療后的子宮炎奶牛已發(fā)情受胎(表1)，說明健宮散降低了TNF-α的含量，原因可能是健宮散中益母草、當歸多糖、川芎等發(fā)揮了抗炎功效，抑制了免疫細胞TNF-α的分泌，改善了奶牛的炎癥程度，使得子宮炎奶牛血清中TNF-α的含量降低。

4 結(jié)論

中藥復(fù)方健宮散通過提高血清中Ig G和Ig M含量來增強機體的免疫防御能力；通過降低血清中IFN-γ和TNF-α含量減小機體的炎癥損傷，對奶牛產(chǎn)后子宮炎有一定的治療效果。