高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選及菌種共酵對(duì)紅曲固態(tài)發(fā)酵的影響

朱 蕊,彭 林,劉雙平,2,韓 笑,2,毛 健,2,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;2.江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院食品生物技術(shù)研究所,如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司,江南大學(xué)(如皋)食品生物技術(shù)研究所,江蘇如皋 226500)

紅曲菌是一種具有我國(guó)傳統(tǒng)特色的絲狀真菌,經(jīng)固態(tài)發(fā)酵得到的產(chǎn)物為紅曲[1]。紅曲作為中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用天然制品,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)[2],多將紫色紅曲菌用于生產(chǎn)[3]。紅曲菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生多種對(duì)人體有益的代謝產(chǎn)物[4-8],其中洛伐他汀具有很強(qiáng)的降膽固醇、降血脂的保健作用[9]。

目前我國(guó)洛伐他汀的生產(chǎn)主要來(lái)源于紅曲菌發(fā)酵,紅曲的固態(tài)發(fā)酵相比于液態(tài)發(fā)酵節(jié)省了發(fā)酵后期的分離純化工作,更安全且容易吸收,可以直接通過(guò)食用達(dá)到治療目的[10-11]。紅曲的發(fā)展方向多集中于紅曲菌菌種選育、優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)提高紅曲中洛伐他汀的含量,降低生產(chǎn)成本[1,12-13]。近年來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)添加一些外源誘導(dǎo)物可以促進(jìn)洛伐他汀的合成[14-16],Sun等[17]發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加真菌誘導(dǎo)劑-擲孢酵母濾液可以提高液態(tài)發(fā)酵的洛伐他汀產(chǎn)量,當(dāng)酵母濾液在第4 d加入時(shí),最高產(chǎn)量可達(dá)446.92 mg/L。研究表明[18],因?yàn)榕囵B(yǎng)條件相似,紅曲菌與酵母菌、乳酸菌或其他真菌誘導(dǎo)子通過(guò)共酵的培養(yǎng)方式能使次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有所提高,這提示其他微生物代謝的某些酶或是產(chǎn)物可能對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)及洛伐他汀的積累有促進(jìn)作用。

因此本文在市售紅曲中篩選出高產(chǎn)洛伐他汀紫色紅曲菌的基礎(chǔ)上,利用特性較優(yōu)的紫色紅曲菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲,采用不同菌種與其共酵的方式進(jìn)一步優(yōu)化其洛伐他汀產(chǎn)量,篩選出共酵優(yōu)秀菌株,并初步探究其誘導(dǎo)機(jī)理,為深度開(kāi)發(fā)藥食兼用的功能性紅曲提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲樣品 從福建寧德、浙江溫州、廣東麗水等地采集市售紅曲樣品10份;秈米 市售;克魯斯假絲酵母Y6、釀酒酵母SY、枯草芽孢桿菌4-LCW、植物乳桿菌X5、米曲霉P7、黃酒酵母S2-1392、釀酒酵母2.2084、畢赤酵母S12、熱帶假絲酵母CS8、貝酵母S.bay 均為本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏菌株,來(lái)源如表1所示;馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽汁瓊脂(MEA)、察氏培養(yǎng)基(CYA) 廣東環(huán)愷威生物科技有限公司;洛伐他汀(純度≥98%) Sigma公司。

表1 不同菌種及其來(lái)源

YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;PRX-450C型智能人工氣候箱 寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SW-CJ系列超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有2489紫外檢測(cè)器及Empower 2色譜工作站) 美國(guó)沃特世公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲篩選分離源指標(biāo)檢測(cè) 選取來(lái)自福建、廣東、浙江等不同來(lái)源的10份市售紅曲米作為篩菌的分離源,初步評(píng)價(jià)市售紅曲,與后續(xù)實(shí)驗(yàn)中純種制曲比較,利用高效液相色譜法測(cè)定市售紅曲中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測(cè)定其色價(jià),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.2 產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選及鑒定

1.2.2.1 紅曲菌的篩選 稱(chēng)取5 g紅曲樣品,在無(wú)菌研缽中研磨成粉末后置于95 mL帶玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中,在搖床上振蕩30 min后進(jìn)行梯度稀釋。吸取0.1 mL涂布于PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)3～4 d,用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至新的PDA平板,經(jīng)過(guò)反復(fù)分離純化,得到具有紅曲菌基本特征的較純菌株,鑒定完畢后甘油管保藏至-80 ℃。

1.2.2.2 菌落形態(tài)觀察 參考《紅曲菌的形態(tài)與分類(lèi)學(xué)》[19],采用三點(diǎn)接種法將菌株分別點(diǎn)種于MEA、PDA和CYA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)7 d,觀察菌落的形態(tài)特征,包括菌落的正反面顏色、質(zhì)地、邊緣等。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 以提取的紅曲菌總DNA[20]為模板,利用真菌ITS通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。所得產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序所得的序列信息利用BLAST程序在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì),利用MEGA6.0軟件對(duì)所測(cè)紅曲菌與序列同源性高的模式菌株的基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析,利用Neighbor-Joining鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 菌種培養(yǎng) 紅曲菌菌株活化:用無(wú)菌接種環(huán)刮取保藏管里的菌種劃線于麥芽汁斜面上。28 ℃培養(yǎng)5～7 d,培養(yǎng)至紅曲菌長(zhǎng)出孢子。

固態(tài)發(fā)酵:用0.1%無(wú)菌吐溫水洗下斜面上的孢子,30 g秈米浸泡2 h后轉(zhuǎn)入250 mL錐形瓶,封口后于121 ℃,0.08 MPa滅菌20 min后,趁熱將米粒拍散,接種106個(gè)孢子/g(大米干重)接種于冷卻至室溫的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,補(bǔ)加無(wú)菌水調(diào)節(jié)含水量在40%～50%;拌勻后使培養(yǎng)基堆至瓶?jī)?nèi)一角,28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后搖散、攤平;此后每24 h搖瓶1～2次,直到14 d發(fā)酵結(jié)束。利用高效液相色譜法測(cè)定紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測(cè)定其色價(jià),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 菌種共酵

1.2.4.1 紅曲菌共酵菌種活化 分別選取1.1中列舉的實(shí)驗(yàn)室保藏菌株于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,28 ℃活化24 h至培養(yǎng)基渾濁。

1.2.4.2 紅曲菌與不同菌種共發(fā)酵 按照1.2.3中固態(tài)發(fā)酵法制備紅曲,同時(shí)將活化后的菌種菌液以2%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基與紅曲菌進(jìn)行共酵實(shí)驗(yàn),以紅曲菌H8-2純種發(fā)酵作為對(duì)照組。利用高效液相色譜法測(cè)定紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測(cè)定其色價(jià),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 添加不同酵母誘導(dǎo)劑的研究 根據(jù)1.2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇釀酒酵母2.2084為共酵菌株,以此制備不同酵母誘導(dǎo)劑。酵母菌液:將釀酒酵母28 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h取樣;酵母發(fā)酵液:將上述釀酒酵母搖瓶24 h后的菌液,4 ℃條件下8000 r/min離心所得上清液;高溫滅菌液:酵母培養(yǎng)24 h后,100 ℃高溫滅菌20 min;酵母破壁液:將釀酒酵母28 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h后,4 ℃條件下8000 r/min離心后用無(wú)菌水洗滌菌體,重復(fù)兩次,將酵母菌體置于含有石英砂的滅菌研缽中研磨10 min,吸取至2 mL離心管中4 ℃條件下8000 r/min離心,所得上清液為酵母破壁液。按照1.2.3中固態(tài)發(fā)酵法制備紅曲,同時(shí)將酵母誘導(dǎo)劑以2%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基與紅曲菌進(jìn)行共酵實(shí)驗(yàn),以紅曲菌H8-2純種發(fā)酵作為對(duì)照組。利用高效液相色譜法測(cè)定紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的洛伐他汀含量,紫外分光光度法測(cè)定其色價(jià),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 洛伐他汀的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[21]檢測(cè)方法,在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)一步優(yōu)化,采用HPLC法,稱(chēng)取紅曲粉0.5 g置于50 mL離心管中,加入甲醇30 mL,50 ℃振蕩水浴2 h,搖勻,常溫條件下8000 r/min離心5 min,取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜。

色譜條件:色譜柱:Athena C18-WP(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%的磷酸水溶液(65∶35,V/V);流速:1.0 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:(30.0±0.5) ℃。以70%乙醇溶液配制400 mg/L的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,等比稀釋制得濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L的洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行外標(biāo)定量。標(biāo)曲線性方程為:y=3.64×104x-2.35×105,決定系數(shù)R2=0.9912。

1.2.7 色價(jià)的測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)法,參考國(guó)標(biāo)GB 4926-2008《食品添加劑 紅曲米(粉)》。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)三次,采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算,采用Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行分析繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選和鑒定

2.1.1 紅曲菌篩選分離源指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)取樣紅曲樣本進(jìn)行初步評(píng)價(jià),由表2可知,取樣的這些市售紅曲洛伐他汀含量較低,基本在1.8～3.5 mg/g之間,色價(jià)質(zhì)量參差不齊,洛伐他汀產(chǎn)量和色價(jià)之間無(wú)必然聯(lián)系。

表2 紅曲分離源指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 紅曲菌株篩選結(jié)果 紅曲菌是一種腐生菌,其生長(zhǎng)適應(yīng)的溫度范圍很廣,最適溫度為25～30 ℃,能利用多種碳源和氮源生長(zhǎng)。相較于其他菌,紅曲菌生長(zhǎng)比較緩慢,因此采用比較普適的PDA培養(yǎng)基平板,在28 ℃下培養(yǎng)5～6 d進(jìn)行篩選。通過(guò)梯度稀釋及反復(fù)分離純化,從上述2.1.1的10份紅曲米中分離疑似霉菌菌株的純培養(yǎng)菌株21株。

根據(jù)進(jìn)一步形態(tài)觀察,并以產(chǎn)紅色素的菌株為挑選標(biāo)準(zhǔn),選取菌落呈現(xiàn)紅色并具有紅曲菌典型特征的菌株進(jìn)一步篩選,共得到10株紅曲菌菌種,分別命名為H1-4、H4-2、H4-4、H6-2、H6-3、H7-2、H8-1、H8-2、H9-2、H10-1。

2.1.3 紅曲菌的固態(tài)發(fā)酵特性比較 為篩選得到高產(chǎn)洛伐他汀的紅曲菌,本研究對(duì)2.1.2中篩選得到的10株紅曲菌進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn),并檢測(cè)發(fā)酵后紅曲中洛伐他汀的含量和色價(jià)。如圖1菌株H8-2的洛伐他汀產(chǎn)量明顯高于其他菌株(圖1a),色價(jià)結(jié)果也較優(yōu)(圖1b)。為進(jìn)一步確定菌株H8-2的發(fā)酵穩(wěn)定性,本研究利用菌株H8-2連續(xù)發(fā)酵三次后(表3),得到洛伐他汀產(chǎn)量基本穩(wěn)定,均值達(dá)到9.79 mg/g(干重),色價(jià)可達(dá)1805.43 μ/g,發(fā)酵制備的紅曲質(zhì)量遠(yuǎn)高于2.1.1中菌種來(lái)源的市售紅曲。說(shuō)明利用H8-2菌株純種制曲可得到高產(chǎn)洛伐他汀的紅曲,故確定菌株H8-2為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供試菌株。

表3 菌株H8-2固態(tài)發(fā)酵情況

圖1 紅曲菌菌固態(tài)發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量(a)和色價(jià)(b)比較

2.1.4 菌株H8-2的鑒定

2.1.4.1 形態(tài)觀察 將菌株H8-2分別點(diǎn)種于MEA、PDA和CYA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)7 d。在相同培養(yǎng)條件下這10株紅曲菌菌落形態(tài)差異很小,其典型菌株形態(tài)如圖2所示,紅曲菌在MEA平板上生長(zhǎng)狀況最好,明顯優(yōu)于PDA平板和CYA平板,在MEA平板上紅曲菌菌落呈絨氈狀,有淺色且短的氣生菌絲,背面呈現(xiàn)出放射狀輻射紋,菌絲體開(kāi)始為白色,隨菌落成熟而變成橙紅色至深紅色,菌落略微隆起,邊緣不整齊。PDA平板上生長(zhǎng)狀況次之,紅曲菌生長(zhǎng)速度較慢,放射狀輻射波紋減少。CYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況最不理想,生長(zhǎng)速度最慢,未見(jiàn)放射狀輻射波紋,菌落顏色也較淺,呈粉色。參考《真菌鑒定手冊(cè)》[22],并根據(jù)《紅曲菌的形態(tài)與分類(lèi)學(xué)》[19]進(jìn)行檢索,對(duì)紅曲菌進(jìn)行初步觀察,鑒定菌株為紫色紅曲菌。

圖2 紅曲菌株H8-2在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 菌株H8-2的rDNA-ITS PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖3所示,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在500～700 bp之間,條帶明亮單一,說(shuō)明特異性擴(kuò)增良好。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序后將得到的受試菌基因序列經(jīng)校對(duì)和拼接后在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)與紫色紅曲菌MonascuspurpureusJCM 6934的同源性達(dá)99%以上,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察,基本可以將此紅曲菌種鑒定為紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)。該菌種是在食品中使用最廣泛的紅曲固態(tài)發(fā)酵菌種。

圖3 紅曲菌株H8-2的rDNA-ITS PCR產(chǎn)物電泳圖

圖4 紅曲菌H8-2的ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 不同菌株與紅曲菌共酵培養(yǎng)對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量及色價(jià)的影響

在我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)中常采用多菌種混合體系進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵過(guò)程中菌種之間的相互作用對(duì)食品的風(fēng)味和功能性物質(zhì)的含量具有直接影響。因此在本研究中,將紅曲菌H8-2與食品中篩選得到的酵母、枯草芽孢桿菌、霉菌、乳酸菌進(jìn)行共酵,發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)紅曲中洛伐他汀和色素含量。

由圖5a可知,相比較紅曲菌H8-2純種制曲的對(duì)照組,除枯草芽孢桿菌4-LCW外,其他菌種的共酵都使洛伐他汀的產(chǎn)量有不同程度的提高,其中酵母菌SY及米曲霉P7顯著提高了紅曲中的洛伐他汀含量,發(fā)酵結(jié)束后洛伐他汀含量分別達(dá)到12.37和12.10 mg/g。圖5b在檢測(cè)不同菌種共酵后紅曲的色素含量后發(fā)現(xiàn),酵母SY共酵后色價(jià)達(dá)到2014.49 μ/g,是所有共酵菌種中紅曲色價(jià)含量最高的菌種。因此,綜合不同菌種共酵對(duì)紅曲洛伐他汀和色素含量的影響后,確定以酵母作為紅曲的共酵菌種進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

圖5 不同菌種對(duì)紅曲洛伐他汀產(chǎn)量(a)和色價(jià)(b)的影響

2.3 不同種類(lèi)酵母菌與紅曲菌共酵對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量及色價(jià)的影響

基于2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)酵母菌更適合與紅曲菌共酵制曲,并對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量有顯著影響。因此選擇實(shí)驗(yàn)室保藏的不同種類(lèi)的7株食品來(lái)源酵母菌,與紅曲菌H8-2共酵制曲,考察不同酵母對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲質(zhì)量的影響,并篩選出優(yōu)良的共酵菌株。由圖6a可知,兩種釀酒酵母2.2084與SY對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量有顯著性提高,其中釀酒酵母2.2084使洛伐他汀產(chǎn)量極顯著提高(p<0.0001),達(dá)12.93 mg/g,產(chǎn)量相比H8-2純種制曲的對(duì)照組提高了34.5%。圖6b共酵對(duì)紅曲色價(jià)的影響,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母2.2084也能使色價(jià)有小幅提高,但不同酵母與紅曲菌共酵對(duì)紅曲色價(jià)的影響都不顯著(p>0.05),說(shuō)明共酵可能對(duì)紅曲色價(jià)的影響不大。因此綜合考慮選擇釀酒酵母2.2084為與紅曲菌H8-2共同發(fā)酵制曲的優(yōu)良共酵菌株,擬用此菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖6 不同酵母菌種對(duì)紅曲中洛伐他汀產(chǎn)量和色價(jià)的影響

2.4 不同酵母誘導(dǎo)劑對(duì)紅曲固態(tài)發(fā)酵中洛伐他汀及色價(jià)的影響

為初步探究共酵使洛伐他汀產(chǎn)量提升的機(jī)理,選擇2.3中最優(yōu)共酵菌種釀酒酵母2.2084制備不同誘導(dǎo)劑,分別添加釀酒酵母菌液、酵母發(fā)酵液、高溫滅菌液和酵母破壁液到紅曲菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中與紅曲菌H8-2進(jìn)行共酵,經(jīng)過(guò)14 d的固態(tài)發(fā)酵后,發(fā)現(xiàn)不同酵母誘導(dǎo)劑都對(duì)洛伐他汀的產(chǎn)量有較明顯的提高,如圖7a所示,其中酵母菌液的提高作用最為顯著(p<0.001)。推測(cè)活的酵母菌液對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀更為有益,可能由于酵母在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中與紅曲菌共酵,持續(xù)生長(zhǎng),從而釋放更多對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量提高有益的誘導(dǎo)因子,使產(chǎn)量顯著提高。而高溫滅菌液、酵母破壁液也能使紅曲固態(tài)發(fā)酵中洛伐他汀的產(chǎn)量顯著提高(p<0.01),產(chǎn)量分別為11.96和12.24 mg/g,分別比H8-2純種制曲的對(duì)照組提高了24.8%和27.8%。由圖7b觀察酵母誘導(dǎo)劑對(duì)紅曲色價(jià)的影響,發(fā)現(xiàn)4種酵母誘導(dǎo)劑均能使色價(jià)有所提高,對(duì)色價(jià)有較好影響,因此酵母對(duì)色價(jià)無(wú)不良影響。趙樹(shù)欣等[23]在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中也做過(guò)類(lèi)似研究,發(fā)現(xiàn)在紅曲菌發(fā)酵初始添加酵母破壁液2.7%(v/v),洛伐他汀的產(chǎn)量可達(dá)61.93 mg/L。分析可能因?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵的狀態(tài)對(duì)共發(fā)酵制曲的影響不同。因此酵母共酵提高紅曲菌洛伐他汀含量的關(guān)鍵物質(zhì)存在于胞內(nèi),且關(guān)鍵物質(zhì)在熱處理后仍保持洛伐他汀促進(jìn)作用,表明關(guān)鍵物質(zhì)對(duì)熱不敏感。對(duì)于酵母中關(guān)鍵物質(zhì)的進(jìn)一步確認(rèn)和探索其誘導(dǎo)機(jī)制,仍需要要進(jìn)一步研究。

圖7 不同酵母誘導(dǎo)劑對(duì)紅曲洛伐他汀產(chǎn)量和色價(jià)的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從市售紅曲中篩選得到一株高產(chǎn)洛伐他汀的紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)H8-2,并通過(guò)與食品來(lái)源菌株共酵的方式進(jìn)一步優(yōu)化紅曲制曲方法。研究表明,紅曲菌與釀酒酵母共酵使洛伐他汀產(chǎn)量由未共酵的9.79 mg/g提高到12.93 mg/g,洛伐他汀含量提高了34.5%,對(duì)色價(jià)無(wú)不良影響,可得到質(zhì)量較高的功能性紅曲。相比市售紅曲中洛伐他汀產(chǎn)量在1.8～3.5 mg/g范圍內(nèi),本研究篩選的菌株純種制曲產(chǎn)洛伐他汀含量遠(yuǎn)高于市售紅曲,并成功建立一種共酵提高紅曲洛伐他汀的方法。在對(duì)釀酒酵母共酵提高紅曲洛伐他汀含量的機(jī)理進(jìn)行初步探究后,發(fā)現(xiàn)促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀的關(guān)鍵物質(zhì)可能存在于酵母胞內(nèi),且熱處理對(duì)關(guān)鍵物質(zhì)的促進(jìn)沒(méi)有負(fù)面影響,此結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步探索關(guān)鍵物質(zhì)的種類(lèi)及其促進(jìn)機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。