N-糖酰胺酶PNGase H+ 最小糖結(jié)構(gòu)作用底物的研究

胡孝春,王 婷,蔡志鵬,劉 麗,JOSEF Voglmeir

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210000)

N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparagines amidase,PNGase)是一種去糖基化酶[1]。它能催化N-糖鏈和天冬酰胺(Asn)殘基之間β-天冬氨?；咸前锋I的斷裂,從而將完整的N-糖鏈由蛋白質(zhì)或多肽上釋放下來(lái)[2-4]。N-糖酰胺酶作為糖組學(xué)研究的重要工具酶,在糖鏈的結(jié)構(gòu)分析和功能研究中都發(fā)揮著重要的作用[5-7]。然而,目前常用的兩種商業(yè)化N-糖酰胺酶PNGase A和PNGase F都各有不足:PNGase A可以釋放所有類型的糖鏈,但無(wú)法作用于糖蛋白,只能作用于糖肽;而PNGase F雖然對(duì)糖蛋白和糖肽都具有活性,但無(wú)法釋放植物來(lái)源的具有核心α-1,3巖藻糖修飾的N-糖鏈。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中,從細(xì)菌Terriglobusroseus中發(fā)現(xiàn)了一種新型N-糖酰胺酶PNGase H+[8]。該酶能夠由原核系統(tǒng)重組表達(dá),并克服了現(xiàn)有商業(yè)酶PNGase F和PNGase A兩者的缺陷。它不僅能夠作用于糖蛋白也能用于糖肽,且能夠釋放所有類型的N-糖鏈,包括具有植物特征性α-1,3巖藻糖核心結(jié)構(gòu)的N-糖鏈,因此PNGase H+在植物來(lái)源的糖蛋白N-糖鏈結(jié)構(gòu)分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[9]。

最小糖結(jié)構(gòu)作用單元是N-糖酰胺酶的一個(gè)重要酶學(xué)特性,明確PNGase作用于N-糖鏈的具體識(shí)別位點(diǎn)以及催化所必須的糖鏈結(jié)構(gòu)和糖分子數(shù)量,是深入研究N-糖酰胺酶酶催化機(jī)理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10-12]。Altmann F發(fā)現(xiàn),PNGase F能夠釋放的最小糖結(jié)構(gòu)作用單元為與Asn相連的二乙酰殼二糖結(jié)構(gòu)(N,N′-diacetylchitobiose),而PNGase A則僅需一個(gè)與Asn連接的N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu),就能夠識(shí)別糖鏈并進(jìn)行水解[13]。在之前的研究中,本實(shí)驗(yàn)室雖然對(duì)N-糖酰胺酶PNGase H+的最適反應(yīng)條件和底物特異性進(jìn)行了研究,但由于缺乏合適的酶解底物,因此未對(duì)其最小糖結(jié)構(gòu)作用單元進(jìn)行探索。

合成具有不同糖鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的糖肽底物是研究PNGase H+最小糖結(jié)構(gòu)作用單元的關(guān)鍵。目前常用的糖肽底物的合成方法主要有化學(xué)合成和酶法合成兩種。化學(xué)合成容易破壞糖鏈結(jié)構(gòu),且通常伴有副產(chǎn)物生成[14-15],酶法具有高效性、特異的區(qū)域選擇性和立體選擇性的特點(diǎn)。Wong等[18]曾利用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng),大批量合成了半乳糖胺。因此酶法可以獲得產(chǎn)率較高的目的產(chǎn)物[16-17]。本文中糖肽底物的合成擬采用糖基水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的方法,糖基水解酶能夠特異性水解糖底物,從而獲得目標(biāo)產(chǎn)物,而糖基轉(zhuǎn)移酶則能將糖基供體上的糖分子轉(zhuǎn)移到糖基受體上,從而獲得目標(biāo)產(chǎn)物。

本研究擬以丹磺酰氯標(biāo)記的糖肽標(biāo)準(zhǔn)品為基礎(chǔ),利用酶法制備不同糖單元大小的糖肽底物,并以此底物對(duì)PNGase H+的活性進(jìn)行檢測(cè),得出PNGase H+的最小糖結(jié)構(gòu)作用單元,從而為PNGase H+的酶催化機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-甘露糖苷酶重組質(zhì)粒、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶重組質(zhì)粒、UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶重組質(zhì)粒、β-N-乙酰氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶 Sigma生物公司;丹磺酰氯標(biāo)記的七糖單元糖肽GNGN(Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc4Man3)-Arg) 由奧地利維也納自然資源與生命科學(xué)應(yīng)用大學(xué)的Thomas Dalik和Friedrich Altmann提供;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲基磺酰氟、卡那霉素、Triton X-100、Ni-NTA親和層析柱、LB液體培養(yǎng)基(5 g NaCl、10 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨) 南京金絲瑞生物公司;乙腈 色譜純,默克公司。

1416R型高速冷凍離心機(jī) 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;GRP-9160型恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;725N型微量分光光度計(jì)One Drop OD-2000 南京五義科技有限公司;Shimadzu LC-30AD型超高效液相色譜配有SPD-20A型紫外檢測(cè)器以及RF-20Axs型熒光檢測(cè)器、SIL-30AC型自動(dòng)進(jìn)樣器、CO-2000型柱溫箱(恒信儀器)、LC solution工作站 島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖肽合成相關(guān)酶的制備

1.2.1.1β-甘露糖苷酶的表達(dá)與純化 將β-甘露糖苷酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞[19]。挑取單菌落于5 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),然后接種至含有400 mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng),直至菌液濃度在OD600處吸光度達(dá)到0.5左右,加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L,18 ℃誘導(dǎo)表達(dá)22 h。4 ℃、4000 r/min離心收集菌體,將菌體沉淀重懸于10 mL裂解液(100 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1% Triton X-100,1 mmol/L苯甲基磺酰氟)超聲破碎細(xì)胞,12000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清,并置于80 ℃水浴鍋中加熱30 min,4 ℃、12000 r/min離心收集上清,并用分子截留量為30 kDa的超濾管對(duì)其進(jìn)行濃縮,4 ℃保存。

1.2.1.2β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與純化 將β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)過(guò)程同1.2.1.1。使用Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化[20],鎳柱使用5倍柱體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris/HCl pH8.0,50 mmol/L NaCl)進(jìn)行平衡后上樣,并使用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液(50 mmol/L Tris/HCl pH8.0,50 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑)沖洗去除非特異結(jié)合的蛋白,再用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris/HCl pH8.0,50 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑)洗脫重組蛋白,280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)柱下液,收集蛋白峰即純化后的重組酶,4 ℃保存[21]。

1.2.1.3 UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的表達(dá)與純化 將UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)和純化過(guò)程同1.2.1.2,4 ℃保存。

1.2.2 丹磺酰氯標(biāo)記糖肽底物的酶法合成

1.2.2.1 五糖單元糖肽的制備 取GNGN(10 pmol/μL)1 mL作為初始底物,加入1 μLβ-N-乙酰氨基己糖苷酶和250 μL pH為7.0的Tris/HCl緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng)[22],得五糖單元糖肽。

1.2.2.2 三糖單元糖肽的制備 以1.2.2.1中反應(yīng)獲得的產(chǎn)物作為底物,取1 mL該底物置于EP管中,加入1 μLα-甘露糖苷酶和250 μL pH為5.5的檸檬酸緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng),得三糖單元糖肽。

1.2.2.3 二糖單元糖肽的制備 以1.2.2.2中反應(yīng)獲得的產(chǎn)物作為底物,取1 mL該底物置于EP管中,加入10 μLβ-甘露糖苷酶和200 μL 400 mmol/L pH為7.4的2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)緩沖溶液,振蕩混勻,于75 ℃金屬浴中反應(yīng)10 min后,95 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng),得二糖單元糖肽。

1.2.2.4 單糖單元糖肽的制備 以1.2.2.3中反應(yīng)獲得的產(chǎn)物作為底物,取400 μL該底物置于EP管中,加入1 μLβ-N-乙酰氨基己糖苷酶和100 μL pH為7.0的Tris/HCl緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng),得單糖單元糖肽。

1.2.2.5 新三糖單元糖肽的制備 以1.2.2.3中反應(yīng)獲得的產(chǎn)物作為底物,取5 μL該底物置于EP管中,加入5 μL MgCl2(10 mmol/L)、1 μL MnCl2(100 mmol/L)、8 μLβ-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶、8 μL UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶及5 μL pH為7.4的AMPD(400 mmol/L)緩沖溶液,振蕩混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h后,金屬浴中95 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng),得糖結(jié)構(gòu)不同的新三糖單元糖肽。

1.2.3 丹磺酰氯標(biāo)記糖肽底物的檢測(cè) 利用超高液相色譜對(duì)1.2.2所制備糖肽進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱:Phenomenex Kinetex? 1.7 μm C18 100? 150×2.10 mm;流動(dòng)相A:超純水(含0.1%甲酸(v/v)),流動(dòng)相B:乙腈(含0.1%甲酸(v/v));流速:0.25 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):UV/Vis 436 nm;進(jìn)樣量:30 μL;柱溫常溫。洗脫程序:0～1 min B 5%,1～30 min B 5%～50%,30～31 min B 50%～95%,31～32 min B 95%,32～33 min B 95%～5%,33～40 min B 5%,50 min結(jié)束程序。

糖肽底物定量分析:利用Labsolutions 軟件進(jìn)行分析,以糖肽GNGN(10 pmol/μL)為外標(biāo),對(duì)制備底物的峰面積積分,計(jì)算底物濃度[13]。

1.2.4 N-糖酰胺酶PNGase H+對(duì)不同糖肽底物酶解活性的測(cè)定

1.2.4.1 N-糖酰胺酶PNGase H+的表達(dá)純化 N-糖酰胺酶PNGase H+的表達(dá)及純化步驟表達(dá)和純化過(guò)程同1.2.1.2,4 ℃保存。

1.2.4.2 PNGase H+對(duì)不同糖肽底物酶解活性的檢測(cè) 分別以五糖單元、三糖單元、二糖單元、單糖單元、三糖新單元糖肽作為反應(yīng)底物,檢測(cè)PNGase H+的酶解活性,反應(yīng)體系:2 μL糖肽底物、2 μL PNGase H+、2 μL pH為2.6的檸檬酸緩沖溶液和4 μL超純水;不加酶底物對(duì)照組:2 μL糖肽底物、2 μL pH為2.6的檸檬酸緩沖溶液和6 μL超純水;產(chǎn)物對(duì)照組:2 μL Dabsyl-Gly-Glu-Asn-Arg、2 μL pH2.6的檸檬酸緩沖溶液和6 μL超純水,振蕩混勻,分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h后,于金屬浴中95 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng),12000 r/min常溫離心機(jī)中離心1 min,利用超高液相色譜進(jìn)行檢測(cè),色譜條件、試驗(yàn)步驟同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel Office 2010數(shù)據(jù)整理,繪圖軟件采用Adobe illustrator進(jìn)行色譜圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹磺酰氯標(biāo)記的糖肽底物的合成

核心五糖結(jié)構(gòu)(由2個(gè)N-乙酰葡糖胺及3個(gè)甘露糖構(gòu)成)是所有種類N-糖鏈的共有結(jié)構(gòu),因此合成具有該糖單元結(jié)構(gòu)以及在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的遞減糖單元結(jié)構(gòu)的特殊糖肽類底物,是N-糖酰胺酶識(shí)別糖單元結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以丹磺酰氯標(biāo)記的七糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc4Man3)-Arg(GNGN)為起始底物,經(jīng)β-N-乙酰氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶依序處理生成相應(yīng)的五糖、三糖和二糖單元糖肽,再進(jìn)一步使用β-N-乙酰氨基己糖苷酶處理產(chǎn)生單糖單元糖肽,所得產(chǎn)物分別由高效液相色譜檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。

圖1 五糖、三糖、二糖和單糖單元丹磺酰氯標(biāo)記糖肽底物液相色譜檢測(cè)圖

七糖單元糖肽底物液相保留時(shí)間為21 min,經(jīng)β-N-乙酰氨基己糖苷酶作用后,核心甘露糖結(jié)構(gòu)上的末端β-N-乙酰氨基葡萄糖被完全水解,生成五糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg,其色譜峰出峰位置發(fā)生后移(保留時(shí)間21.5 min),所得產(chǎn)物純度為100%,濃度為8.3 pmol/μL。該五糖單元糖肽在α-甘露糖苷酶的作用下,末端的α-1,3和α-1,6連接甘露糖被完全解離,生成三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg,其色譜峰位置后移至22 min,所得產(chǎn)物純度為100%,濃度為7.0 pmol/μL。隨后在β-甘露糖苷酶的作用下,與二乙酰殼二糖相連的β-甘露糖被解離,生成二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg,保留時(shí)間為22.5 min,所得產(chǎn)物純度為100%,濃度為6.5 pmol/μL。最后再次經(jīng)β-N-乙酰氨基己糖苷酶的作用,生成單糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg,部分色譜峰后移至23 min,所得產(chǎn)物純度約為70%,濃度為4.5 pmol/μL。

此外,為了保證最小糖單元結(jié)構(gòu)研究的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)還以二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg為底物,通過(guò)β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用,生成了一種非自然存在的三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg。根據(jù)液相色譜圖2所示,二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg的色譜峰液相保留時(shí)間為22.5 min,經(jīng)β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng),生成新三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg(保留時(shí)間22 min),該三糖單元糖肽的純度為100%,濃度為6.5 pmol/μL。

圖2 新三糖單元丹磺酰氯標(biāo)記糖肽底物色譜檢測(cè)圖

通過(guò)上述反應(yīng),制備了五種不同的糖單元糖肽,其名稱、結(jié)構(gòu)和濃度如表1所示。這五種糖單元糖肽都是以核心五糖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),在特異性糖苷酶的作用下,糖單元的數(shù)量或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而合成了目標(biāo)糖肽底物,為后續(xù)測(cè)定PNGase H+最小糖結(jié)構(gòu)作用底物的探究提供了基礎(chǔ)。

表1 丹磺酰氯標(biāo)記糖肽底物結(jié)構(gòu)及濃度

2.2 N-糖酰胺酶PNGase H+對(duì)不同丹磺酰氯標(biāo)記糖單元糖肽底物的酶解作用

2.2.1 PNGase H+對(duì)五糖單元糖肽的酶解作用 以五糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg為底物,檢測(cè) PNGase H+對(duì)該底物的酶解效果。反應(yīng)16 h后,產(chǎn)物通過(guò)液相色譜進(jìn)行檢測(cè),并與丹磺酰氯標(biāo)記的Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg的液相圖譜進(jìn)行比較,確定PNGase H+對(duì)五糖單元糖肽的酶解效果,檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。底物五糖單元糖肽的色譜峰(保留時(shí)間21.5 min)發(fā)生完全偏移,生成的產(chǎn)物色譜峰(保留時(shí)間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠?qū)⑽逄菃卧獜奶请纳贤耆怆x下來(lái)。已往對(duì)PNGase H+的底物特異性研究顯示,PNGase H+能夠作用于高甘露糖型、復(fù)雜型和雜合型所有種類的N-糖鏈[23],而核心五糖作為這些N-糖鏈的共有結(jié)構(gòu),PNGase H+也應(yīng)對(duì)其具有酶解效果,本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論。

圖3 PNGase H+對(duì)五糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.2 PNGase H+對(duì)三糖單元糖肽的酶解作用 以三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man)-Arg為底物對(duì)PNGase H+的酶解作用進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖4所示。反應(yīng)16 h后,底物三糖單元糖肽的色譜峰(保留時(shí)間22 min)發(fā)生完全偏移,生成的產(chǎn)物色譜峰(保留時(shí)間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠?qū)⑷菃卧请纳系腘-糖鏈完全解離。在反應(yīng)底物的制備過(guò)程中,通過(guò)α-甘露糖苷酶的作用,N-糖鏈結(jié)構(gòu)五糖核心末端兩個(gè)α-連接的甘露糖被解離,只留下與核心N-乙酰殼二糖相連的β-甘露糖。這種三糖單元糖肽雖然不具備完整的五糖核心,但也是自然界存在的一種N-糖鏈結(jié)構(gòu),如曾有相關(guān)報(bào)道在大豆糖蛋白的N-糖鏈分析中鑒定出該結(jié)構(gòu)[24]。試驗(yàn)結(jié)果表明,即使消去了五糖核心的末端兩個(gè)α-連接的甘露糖,PNGase H+依舊能夠很好地識(shí)別,并釋放該糖鏈結(jié)構(gòu)。

圖4 PNGase H+對(duì)三糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.3 PNGase H+對(duì)二糖單元糖肽的酶解作用 以二糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg為底物對(duì)PNGase H+對(duì)酶解作用進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果如圖5所示。反應(yīng)16 h后,底物二糖單元糖肽的色譜峰(保留時(shí)間22.5 min)發(fā)生完全偏移,生成的產(chǎn)物色譜峰(保留時(shí)間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠?qū)⒍菃卧请纳系腘-糖鏈完全解離。該二糖單元底物在五糖核心結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,通過(guò)α-甘露糖苷酶和β-甘露糖苷酶的共同作用,所有甘露糖基均被解離,只留下核心N-乙酰殼二糖。試驗(yàn)結(jié)果表明,即使只剩核心N-乙酰殼二糖結(jié)構(gòu),PNGase H+依舊能夠很好地識(shí)別并釋放該糖鏈結(jié)構(gòu),該結(jié)果與已往的報(bào)道一致。如Altman等發(fā)現(xiàn),PNGase F和PNGase A均能水解連接有N-乙酰殼二糖的六肽底物[13]。晶體結(jié)構(gòu)研究也證明,N-乙酰殼二糖能夠結(jié)合在PNGase F的活性中心[25]。此外Fan等發(fā)現(xiàn),PNGase F對(duì)含有苯丙氨酸(Phe)氨基酸殘基的N-乙酰殼二糖糖肽活性極低[26]。這說(shuō)明除了糖鏈結(jié)構(gòu)與糖單元數(shù)量,肽段的氨基酸序列對(duì)于N-糖酰胺酶的酶解作用也有一定影響,而本實(shí)驗(yàn)使用的糖肽底物中不含有苯丙氨酸,不會(huì)對(duì)PNGase H+的活性檢測(cè)造成影響。

圖5 PNGase H+對(duì)二糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.4 PNGase H+對(duì)單糖單元糖肽的酶解作用 以單糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg為底物對(duì)PNGase H+的酶解作用進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果如圖6所示。前期制備的單糖單元糖肽純度僅為70%,其中還含有30%的二糖單元糖肽,加入PNGase H+反應(yīng)16 h后,可見(jiàn)保留時(shí)間為22.5 min的二糖單元糖肽的色譜峰完全消失,同時(shí)保留時(shí)間24.5 min檢測(cè)到丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg,而單糖分子糖肽的底物色譜峰(保留時(shí)間為23 min)峰高和峰面積均無(wú)明顯變化,表明PNGase H+對(duì)單糖分子糖肽活性極弱,無(wú)法將N-乙酰葡糖胺從單糖分子糖肽上解離下來(lái)。PNGase F的晶體結(jié)構(gòu)研究中顯示,酶活性中心谷氨酸殘基118位(Glu118)能夠與第二位N-乙酰葡萄糖胺6′位的氧形成氫鍵,從而提高對(duì)糖鏈的結(jié)合能力,由此可見(jiàn)第二位的N-乙酰葡萄糖胺對(duì)PNGase F的活性具有重要影響[25]。而本試驗(yàn)結(jié)果表明,PNGase H+與PNGase F相似,能夠作用的最小糖鏈結(jié)構(gòu)為N-乙酰殼二糖,而其酶活性中心是否存在氨基酸殘基能夠與第二位N-乙酰葡萄糖胺形成氫鍵,還需進(jìn)一步的晶體結(jié)構(gòu)研究驗(yàn)證。

圖6 PNGase H+對(duì)單糖單元糖肽酶解作用液相色譜圖

2.2.5 PNGase H+對(duì)三糖新單元糖肽的酶解作用 為了進(jìn)一步驗(yàn)證N-乙酰殼二糖為PNGase H+的最小糖結(jié)構(gòu)作用單元,以人工合成的非天然三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg為底物對(duì)PNGase H+的酶解活性進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果如圖7所示。反應(yīng)16 h后,底物三糖單元糖肽的色譜峰(保留時(shí)間22 min)發(fā)生完全偏移,生成的產(chǎn)物色譜峰(保留時(shí)間24.5 min)與丹磺酰氯肽段Dabsyl-Gly-Glu-Asp-Arg完全一致,從而判定PNGase H+能夠?qū)⒃撊菃卧请纳系腘-糖鏈完全解離。自然存在的N-糖鏈構(gòu)象中,與核心N-乙酰殼二糖相連的糖基一般是甘露糖而非半乳糖[27]。然而PNGase H+一樣能夠高效的水解釋放該種糖鏈,說(shuō)明第三位的半乳糖基并未影響糖鏈與PNGase H+活性中心的結(jié)合,進(jìn)一步驗(yàn)證了PNGase H+的最小糖結(jié)構(gòu)作用單元為N-乙酰殼二糖的推斷。

圖7 PNGase H+對(duì)三糖新單元糖肽酶解作用液相色譜圖

3 結(jié)論

本研究首先利用生物學(xué)的方法成功表達(dá)純化出了β-半乳糖苷酶和β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶,然后以磺酰氯標(biāo)記的復(fù)雜型七糖單元糖肽標(biāo)準(zhǔn)品為初始底物,利用酶法合成獲得了5種不同結(jié)構(gòu)的糖肽底物,以合成的底物為基礎(chǔ),通過(guò)高效液相色譜來(lái)檢測(cè)PNGase H+對(duì)底物的酶解效果,從而得出N-糖酰胺酶PNGase H+的最小糖結(jié)構(gòu)作用底物,實(shí)驗(yàn)表明,利用酶法成功制備出了5種不同結(jié)構(gòu)的糖肽底物Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Man3)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2 Man)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2)-Arg、Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg和Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg,濃度分別為8.3、7.0、6.5、4.5、6.5 pmol/μL。PNGase H+不僅能夠作用于糖單元數(shù)為二、三和五的三種不同的天然構(gòu)象糖肽,且能夠作用于人工合成的非天然構(gòu)象的三糖單元糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc2Gal)-Arg,但不能酶解只具有單個(gè)N-乙酰葡糖胺的糖肽Dabsyl-Gly-Glu-Asn-(GlcNAc)-Arg,由此推斷PNGase H+的最小糖結(jié)構(gòu)作用單底物為帶有N-乙酰殼二糖的糖肽。