手性自組裝短肽對子宮創(chuàng)傷修復的影響

吳書祎，蘭世建，文靜，趙天鑫，黃嵐，羅忠禮

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手性自組裝短肽對子宮創(chuàng)傷修復的影響

吳書祎，蘭世建，文靜，趙天鑫，黃嵐，羅忠禮

重慶醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，重慶 400016

本研究旨在探索手性自組裝短肽在大鼠子宮創(chuàng)傷修復過程中發(fā)揮的作用。通過圓二色譜儀分析手性自組裝短肽的二級結構；剛果紅染色觀察短肽自組裝過程；紅細胞裂解實驗檢測短肽對細胞膜的裂解作用；通過在模擬子宮創(chuàng)傷大鼠模型上引入手性自組裝短肽，利用HE染色及免疫組織手段分析其在子宮創(chuàng)傷修復過程中的影響。結果顯示，手性自組裝短肽二級結構均為穩(wěn)定的β折疊；可在鹽離子觸發(fā)下自組裝形成致密的膜狀結構；短肽自組裝前后對細胞膜無裂解作用；可為細胞提供三維培養(yǎng)支架；Hela細胞在短肽形成的水凝膠環(huán)境中可持續(xù)生長；動物實驗結果表明，手性自組裝短肽可明顯加快子宮修復過程。手性自組裝短肽作為新型生物工程材料，可構建細胞三維培養(yǎng)環(huán)境并用于子宮創(chuàng)傷修復。

手性自組裝短肽，子宮創(chuàng)傷修復，大鼠模型

子宮為胚胎植入和生長提供了最重要的內部環(huán)境，在妊娠建立與維持方面有著不可替代的作用。我國每年約有1 300萬次人工流產發(fā)生，手術中機械性的刺激損傷可能造成感染、內膜變薄等[1-4]，進而影響子宮腔的正常形態(tài)功能，最終導致不孕、習慣性流產等產科疾病。而子宮環(huán)境的復雜性，決定了藥物很少能直接作用于患處。

子宮病理性創(chuàng)傷后自發(fā)修復困難。內膜與基底層同時受損，可導致內膜干細胞受損或缺失。與此同時，局部感染和炎癥破壞干細胞微環(huán)境[5-6]，導致細胞修復障礙，血管再生受阻，腺體減少萎縮，進而造成宮腔局部內膜缺失，宮壁產生纖維化或粘連等現象[7-8]。

自組裝短肽是一種新型納米生物支架材料，具有構建仿細胞外基質(Extracellular matrix，ECM) 的功能，能部分模擬ECM功能[9-11]。且自組裝短肽僅由氨基酸構成，對生物體無毒害作用[12]，具有良好的生物相容性[13]。本課題組在前期研究中發(fā)現自組裝短肽在心肌修復、快速止血、皮膚創(chuàng)傷[14-16]等再生修復方面具有良好應用。

本研究選用的自組裝短肽Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ均由16個氨基酸殘基構成，純度分別是96.18%與97.03%。我們通過理化性質實驗研究Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ自組裝形態(tài)及效果；體外細胞實驗檢測其是否具有良好的生物相容性；通過動物實驗分別探究Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ對子宮創(chuàng)傷模型的修復效果。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的手性自組裝短肽Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ由成都賽恩貝生物技術有限公司贈送；磷酸鹽緩沖劑 (PBS, 北京鼎國昌盛)；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶 (Hyclone，美國)；青霉素混合液 (Genview，美國)；4%多聚甲醛固定液、DAB顯色試劑盒 (上海碧云天)；剛果紅染液 (Genivew，美國)；免疫組織化學染色試劑盒 (北京中杉新橋)；兔抗MMP-9抗體、鼠抗VEGF抗體(Proteintech，美國)；孕馬血清注射用血促性素 (PMSG，赤峰波恩藥業(yè)，批號：獸藥字(2012) 050074564)；注射液用絨促性素 (HCG，麗珠制藥)；去離子水；生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 短肽溶液配制

分別稱取Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ凍干粉末各10 mg，1 mL去離子水溶解，制成10 mg/mL短肽母液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩５润w積PBS溶液與短肽母液混合，放置于室溫下，短肽可發(fā)生自組裝現象，得到濃度5 mg/mL短肽水凝膠。

1.2.2 檢測分析短肽二級結構

圓二色譜儀 (AVIV 400 CD sepectrometer) 對Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ進行CD檢測：分別用PBS與短肽母液配制100 μmol/L Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ溶液，取400 μL于石英比色皿中，室溫下進行CD檢測[16]。

參數設置：掃描波長190?260 nm，波長間隔0.5 s，光徑2 mm。導入測量值，根據下列公式計算[θ]值，橫坐標為波長，縱坐標[θ]作圖[16]。

[θ]=[m(deg)]/[10(peptide)ln]

1.2.3 宏觀觀察短肽自組裝過程

用PBS與短肽母液分別配制5 mg/mL Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ溶液，37 ℃孵育24 h，在自組裝過程第0 h、4 h和24 h，分別吸取10 μL Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ溶液滴于載玻片上，剛果紅染色約20?30 s，鏡檢觀察[16]。

1.2.4 紅細胞裂解實驗

1) 生理鹽水與去離子水分別配制濃度為1、10、100 μg/mL的Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ溶液；2) 取SD大鼠腹主動脈血，EDTA抗凝，2 000 r/min離心15 min，棄上清；生理鹽水洗滌離心3次，至上層澄清透明；3) 分別使用3種不同濃度的短肽溶液稀釋紅細胞懸液，至其終濃度為2%，作為實驗組；去離子水稀釋紅細胞懸液為陽性對照組；生理鹽水稀釋紅細胞懸液為陰性對照組；4) 樣本置于37 ℃下水浴孵育1 h，5 000 r/min離心15 min；吸取200 μL上清液，酶標儀檢測其在570 nm處的吸光度值。

1.2.5 構建Hela細胞貼壁和空間三維培養(yǎng)體系

細胞貼壁培養(yǎng)：將Hela細胞復蘇后加入培養(yǎng)基重懸為細胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入高糖DMEM培養(yǎng)基 (10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞三維培養(yǎng)：待細胞二維培養(yǎng)生長覆蓋率達90%時進行三維培養(yǎng)。用去離子水和短肽粉末分別配制5 mg/mL Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ短肽溶液，4 ℃保存。0.25%胰蛋白酶消化后離心，棄上清液加入蔗糖溶液吹打重懸，將細胞濃度調整為約1×105個/mL，分別加入等體積Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ短肽溶液，將混合液滴加入96孔板，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育5 min，然后每孔加入100 μL培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育。

1.2.6 CCK-8檢測三維環(huán)境中細胞活性

1) 取96孔板中貼壁和空間三維培養(yǎng)的Hela細胞，在實驗第1、3、5天進行酶標儀檢測；2) 每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2–4 h；3) 檢測450 nm處吸光度() 值，其中值越大，則細胞活力越強，細胞增殖數量越多。

1.2.7 制備大鼠假孕模型

雌性SD大鼠于頸部皮下注射50 IU PMSG，48 h后皮下注射30 IU HCG，定義注射HCG 24 h后，為假孕第１天[17]。

1.2.8 建立大鼠子宮創(chuàng)傷模型

1) 體重200-220 g的SD假孕模型大鼠，提前8 h對動物禁食，7%水合氯醛溶液按0.4 mL/100 g進行麻醉。將麻醉后動物固定在特定試驗臺上，備皮消毒；2) 沿腹白線，距恥骨聯(lián)合上方約2 cm處，縱切一個約2.5?3 cm的切口，依次切開皮膚、肌層、腹膜，進入腹腔，暴露Y型子宮；3) 在距子宮交匯處約1 cm處，水平作一個約0.5 cm的切口，放入特制刮宮針，沿子宮系膜對側宮腔行走約1 cm后退出；4) 右側子宮用微量注射器沿劃痕注入30 μL 5 mg/mL Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ短肽溶液，右側注入等量生理鹽水；5) 縫合子宮，溫熱生理鹽水沖洗腹腔，依次縫合關閉腹腔；6) 術后第3、7、14天頸椎脫臼處死大鼠，組織取材。用4%多聚甲醛溶液浸泡子宮組織樣本，48 h 后石蠟包埋并切片、制片。

1.2.9 子宮組織蘇木精-伊紅(HE) 染色

1) 組織包埋塊脫蠟：放入二甲苯-Ⅰ浸泡10 min后，再放入二甲苯-Ⅱ浸泡5 min；2) 梯度水化處理：放入100%酒浸泡1min后；放入95%酒精浸泡30 s；再放入80%酒精浸泡30 s；最后放入75% 酒精浸泡30 s；用自來水沖洗2–3次，每次約5 min；3) 染色：蘇木素染色8 min；自來水沖洗2–3次；1%鹽水乙醇6 s；氨水反藍作用20 s，自來水沖洗；鏡檢至細胞核呈清晰藍色；伊紅染色2 min，自來水沖洗；4) 梯度脫水處理：放入80% 酒精浸泡30 s后；再放入95% 酒精浸泡30 s；然后放入100% 酒精浸泡5 min；最后放入無水酒精浸泡2 min；5) 透明：放入二甲苯-I浸泡2 min，再放入二甲苯-II浸泡2 min；6) 中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.2.10 子宮組織免疫組織化學染色

1) 烤片：切片置于60 ℃ 電熱恒溫烤箱，過夜；2) 組織包埋塊脫蠟：放入二甲苯-I浸泡10 min后，再放入二甲苯-Ⅱ浸泡5 min；3) 梯度水化處理：放入100%酒浸泡1 min后；放入95%酒精浸泡30 s；再放入80%酒精浸泡30 s；最后放入75% 酒精浸泡30 s；用自來水沖洗2–3次，每次約5 min；4) 修復：放入0.1 mol/L檸檬酸混合液，高溫加熱至沸騰，自然冷卻。去離子水沖洗5 min，PBS沖洗5 min；5) 阻斷：3% H2O2孵育15 min，阻斷內源性過氧化物，PBS沖洗10 min；6) 滴入一抗，4 ℃ 孵育過夜；7) 室溫孵育30 min，滴入二抗，孵育30 min；8) DAB顯色；9) 蘇木素染色，脫水處理步驟同前；10) 中性樹脂封片，光鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 手性自組裝短肽自組裝形態(tài)及效果

短肽Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ在37 ℃下孵育24 h后，可在倒置EP管中觀察到其呈現凝膠狀(圖1)；進一步剛果紅染色檢測，我們發(fā)現短肽在鹽離子溶液中自組裝0 h時，呈現較為分散的細密流沙狀結構；4 h時，出現松散膜片結構；24 h后，Sciobio-Ⅱ和Sciobio-Ⅲ形成了顏色透明、穩(wěn)定均一的膜結構(圖2)，其中Sciobio-Ⅱ成膜速度更快。由此，我們初步推測Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ，可為細胞培養(yǎng)提供足夠的支撐，從而進行下一步實驗。

圖1 Sciobio-Ⅱ和Sciobio-Ⅲ水凝膠效果圖

圖2 Sciobio-Ⅱ和Sciobio-Ⅲ的剛果紅染色圖(Scale bar=200 μm)

2.2 手性自組裝短肽的二級結構特征

經過圓二色譜(CD) 分析，兩條自組裝短肽的二級結構均為穩(wěn)定的β折疊結構。且Sciobio-Ⅱ 在198 nm處有一強正峰，在212 nm處有一強負峰。Sciobio-Ⅲ與Sciobio-Ⅱ呈鏡像相關，在198 nm處有一強負峰，212 nm處有一強正峰(圖3)。

2.3 紅細胞膜裂解實驗

通過分析數據可得，3種不同濃度的Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ短肽溶液(1、10、100 μg/mL) 均對紅細胞的裂解程度較低。與陽性對照組裂解度相差30%左右。結果表明，手性自組裝短肽在自組裝24 h前后對細胞膜都沒有破壞與裂解作用，可作為下一步動物實驗材料參與大鼠子宮創(chuàng)傷修復實驗(圖4)。

2.4 細胞在二維、三維環(huán)境中的形態(tài)觀察

光學顯微鏡下觀察可以看到，在二維培養(yǎng)中Hela細胞呈貼壁生長，分布均勻，細胞多為菱形；在三維培養(yǎng)中，細胞為圓球形，細胞透亮邊界清晰，表現為分層生長。在三維環(huán)境中，細胞相較于二維環(huán)境生長較為緩慢，但生長狀態(tài)較好，細胞數量持續(xù)增長(圖5)。

圖3 Sciobio-Ⅱ和Sciobio-Ⅲ的圓二色譜圖

圖4 紅細胞裂解實驗

圖5 Hela細胞在貼壁與三維培養(yǎng)環(huán)境中第3天的生長狀態(tài)(Scale bar=200 μm)

2.5 細胞在貼壁和空間三維環(huán)境中的CCK-8 (Cell counting kit-8)檢測

CCK-8檢測結果顯示，Hela細胞在由Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ構建的空間三維環(huán)境中增速與二維環(huán)境相比較為緩慢，但未出現細胞數量減少，說明Hela細胞可以在Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ構建的三維環(huán)境中生長，短肽Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ對細胞正常生長、增殖無抑制作用(圖6)。

2.6 大鼠子宮組織HE染色

實驗第3天，Sciobio-Ⅱ短肽組基層細胞排列基本有序，Sciobio-Ⅲ短肽組腺體形態(tài)與Sciobio-Ⅱ 組相比較為混亂，對照組宮腔內可見脫落物，內膜形態(tài)異常，內膜層與基層界限模糊。第5天，Sciobio-Ⅱ組基層細胞增多，Sciobio-Ⅲ組較Sciobio-Ⅱ組仍可見基層細胞排列紊亂，對照組出現膜上皮細胞粘連。實驗第14天，短肽組基本完成修復過程，與Sciobio-Ⅲ組相比，可見Sciobio-Ⅱ組基底層細胞數量更多，且排列趨向規(guī)律，腺體增多；對照組仍可見內膜與腺體出現復層扁平上皮細胞，腺體上皮細胞異常(圖7)。

圖6 Hela細胞在貼壁、三維體系中的CCK-8檢測

2.7 免疫組織化學染色

實驗選取在子宮修復過程中發(fā)揮重要作用的基質蛋白酶-9 (MMP-9) 與血管內皮生長因子(VEGF) 進行免疫組織化學染色。結果顯示：實驗第7天，VEGF主要表達在Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ腔內膜上皮、腺體上皮廣泛表達，對照組陽性表達水平較低；第14天，3組均可見VEGF陽性水平上升，短肽組表達量更高，其中Sciobio-Ⅱ組在近腔側基質中表達略高于Sciobio-Ⅲ組。MMP-9主要在近肌層基質中，實驗第7天，短肽組陽性表達均高于對照組，其中Sciobio-Ⅱ組陽性水平略高于Sciobio-Ⅲ組；第14天，對照組中陽性表達分散在內膜基質中，短肽組仍集中在近肌層基質，其中Sciobio-Ⅲ組表達水平略高于Sciobio-Ⅱ組(圖8)。

圖7 手性自組裝短肽對子宮修復的HE染色圖(Scale bar=200 μm)

圖8 手性自組裝短肽對子宮修復的免疫組織化學染色(Scale bar=100 μm)

3 討論

子宮創(chuàng)傷是人工流產術后常見損傷，臨床上，宮腔手術或感染一旦損傷子宮內膜基底層，會導致上皮、間質細胞再生障礙，新生血管形成受損，內膜難以實現自我修復[11]，宮腔缺乏內膜覆蓋，壁層可發(fā)生纖維化、瘢痕化及粘連，進而產生宮腔粘連(IUA)、月經不止、子宮瘢痕等并發(fā)癥[17-19]。傳統(tǒng)組織工程支架材料如合成聚酰類、去細胞基質、膠原類等存在組織強度大[20]、制備工序復雜和機械強度不足等缺點[21-22]。因此，構建適合體內培養(yǎng)的優(yōu)質支架材料，成為子宮組織工程研究的關鍵。

本研究所用兩條自組裝短肽是由氨基酸合成的新型高分子材料，具有良好的生物相容性[23-25]，在室溫下均可自組裝形成水凝膠結構；同時圓二色譜 (CD) 結果顯示，Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ均可自組裝形成納米纖維交織的膜狀結構，兩者的二級結呈鏡像相關的β折疊結構，其中Sciobio-Ⅱ的成膜速率更快。通過上述結果我們推測，Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅱ可為組織細胞提供一定的強度支撐，且構建成分單一、結構穩(wěn)定。通過體外紅細胞裂解實驗與CCK-8細胞活性檢測，提示在自組裝短肽構建三維培養(yǎng)體系中，Hela細胞可持續(xù)生長，其中Sciobio-Ⅱ組細胞活動狀態(tài)更加穩(wěn)定。以上結果提示，手性自組裝短肽對細胞無裂解作用，且細胞能在短肽形成的三維環(huán)境中持續(xù)增殖。動物實驗我們制備假孕大鼠模擬刮宮術構建子宮創(chuàng)傷模型，結果顯示，與對照組相比，短肽組中組織修復速度更快。在7 d與14 d兩個時間點，短肽組VEGF表達量均高于對照組，其中Sciobio-Ⅱ組陽性水平更高。同時，與對照組相比，Sciobio-Ⅱ及Sciobio-Ⅲ實驗組MMP-9表達量更穩(wěn)定，其中Sciobio-Ⅱ與Sciobio-Ⅲ相比，兩個時間點MMP-9表達量提升幅度更小。有研究者認為組織修復前期MMP-9高表達有利于細胞增殖與細胞外基質(ECM) 分泌[26-28]，后期相對低表達可促進多余ECM吸收，消除水腫。由此我們推測手性自組裝短肽在促進子宮修復過程中模擬了部分ECM功能，改善了創(chuàng)面細胞微環(huán)境，從而促進部分生長因子與蛋白的表達釋放，加快創(chuàng)傷修復進程。

但手性自組裝短肽促進修復的分子機制，以及其作為組織工程支架材料與種子細胞、生長因子結合應用研究，還需要進一步探索。期望其能為臨床減少宮腔術后并發(fā)癥提供新材料和新思路，并具有更廣泛的研究價值與市場前景。

致 謝 感謝成都賽恩貝公司對本研究的贊助和支持。

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Chirality Self-assembling peptide for rats endometrial regeneration model

Shuyi Wu, Shijian Lan, Jing Wen, Tianxin Zhao, Lan Huang, and Zhongli Luo

College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Here we investigate the physical and chemical properties of chiral self-assembling peptides and the role of uterine trauma regeneration. The circular dichroism was used to analyze secondary structure of chiral self-assembled peptide, and Congo red staining was used to observe the macroscopic process of peptide self-assembling. Erythrocyte lysis assay was used to examine the cleavage of peptide on cell membrane. The nanofiber scaffolds self-assembled by Chiral self-assembling peptides were used as the three-dimensional culture material to observe the growth effect of Hela cell. CCK-8 (cell counting kit-8) was used to study cell viability level between 2D (2-dimensional) and 3D (3-dimensional) culture environment. Rats endometrium curettage model was founded to evaluate the changes by immunohistochemistry staining and and HE staining. The secondary structure of chiral self-assembling peptides was stable β-sheet, and peptide could form dense membrane structure after 24 hours self-assembling cultured in salt ions. There was no harmful for the cell membrane of the peptide before and after self-assembling. Animal experiments show that chiral self-assembling peptide can significantly reduce the inflammatory response, promote the production of neovascularization, and accelerate the repair process. Chiral self-assembling peptide, as a new type of scaffold material, can construct a three-dimensional cell culture environment and used to repair uterine trauma.

Chiral Self-assembling peptide, uterine repair, rats model

December 11, 2018;

March 4, 2019

Zhongli Luo. E-mail: Zhongliluo@163.com

10.13345/j.cjb.180515

吳書祎, 蘭世建, 文靜, 等. 手性自組裝短肽對子宮創(chuàng)傷修復的影響. 生物工程學報, 2019, 35(6): 1079–1087.

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(本文責編 陳宏宇)