丁香精油—殼聚糖納米膠囊的制備及表征

何 鵬 張慧蕓 康懷彬 趙夢月 李銀輝 李森杰 張海艷 曹笑菲

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

微膠囊技術是指利用高分子聚合物薄膜，將氣體、液體和固體進行包埋的微型封裝技術[1]。由于納米膠囊特有的納米尺寸效應，與傳統(tǒng)微膠囊相比，其具有更好的生物相容性、靶向性和緩釋性，能夠有效降低生物活性物質的敏感性大大提高活性物質的生物利用率[2]，近年來對納米級微膠囊的開發(fā)利用已成為研究熱點。在食品工業(yè)中，納米膠囊作為功能性活性物質的新型載體，增加了這些物質的可利用范圍，尤其對難溶性物質可起到良好的增溶效果，增強其作用[3]，更好地被利用。

在食品中添加抗菌劑和抗氧化劑可以控制酸敗的發(fā)展，延緩有毒產(chǎn)物的形成，保持營養(yǎng)質量，延長產(chǎn)品的保質期[4]。由于某些合成抗菌劑和抗氧化劑對健康有負面影響[5]，所以食品工業(yè)要求用天然抗氧化劑來取代合成抗菌劑[6]和抗氧化劑[7]，特別是肉類行業(yè)[8]。丁香一直是最有價值的香料之一[9]，數(shù)百年來被世界各地廣泛應用。丁香精油是由丁香花蕾、莖、葉中提取而來，其主要成分為丁香酚、β-石竹烯、蛇麻烯(α-石竹烯)、乙酸丁香酚酯[10-11]。丁香精油具有防腐[12]、抗氧化[13]、鎮(zhèn)痛[14]和神經(jīng)保護[15]等多種藥用價值，因此在醫(yī)藥[16]、食品[17]和化妝品行業(yè)中備受關注。但由于丁香精油具有較強烈的特殊風味、易揮發(fā)、不溶于水，且對光、氧和溫度較為敏感等原因，極大地限制了其在食品防腐方向的利用。

殼聚糖作為一種具有生物相容性、可降解性以及良好成膜性的天然高分子物質[18]被作為增稠劑和被膜劑列入中國食品添加劑使用標準。殼聚糖是由甲殼素脫乙酰得到的，也是自然界中唯一存在的堿性多糖，成本低廉、來源較廣，因此將其作為包埋蛋白質、多肽、維生素、功能油脂等物質的壁材[19]。殼聚糖納米膠囊常用制備方法有離子凝膠法、共價偶聯(lián)法、大分子復合法和自組裝法等。其中離子凝膠法制備工藝簡單便捷，反應條件溫和，納米粒粒徑均勻、性質穩(wěn)定[20]，近年來國內外對微膠囊化植物精油方面研究較多[21]，但對丁香精油—殼聚糖納米膠囊的研究卻鮮有報道。傳統(tǒng)微膠囊粒徑一般在5～200 μm不等，較大粒徑導致傳統(tǒng)微膠囊分散性不好、對芯材保護能力有限且與細胞接觸面積較小，對于生物活性物質的釋放速率和利用率不能夠起到很好的控制效果；與傳統(tǒng)微膠囊相比，將生物活性物質進行納米級封裝可大大減小膠囊粒徑、增加膠囊比表面積，同時提高了包埋率和芯材物質的釋放面積[22]。在亞細胞尺寸下的納米膠囊擁有更好的分散性和穩(wěn)定性，以及較高的細胞吸收和特異性，大大提高了生物活性物質的生物利用率。

本試驗擬以殼聚糖為壁材，以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，采用離子凝膠法制備丁香精油—殼聚糖納米膠囊，研究制備條件對納米膠囊包埋率及粒徑的影響，并對所制備納米膠囊進行表征分析，為縮小與國外天然活性保鮮劑方面的研究差距，擴大精油在食品工業(yè)中的應用范圍，開發(fā)新型精油保鮮劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香精油：丁香酚含量85.0%，上海國藥集團化學試劑有限公司；

殼聚糖：脫乙?；?5.0%，北京酷爾化學科技有限公司；

吐溫-80：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；

多聚磷酸鈉：分析純，天津市津北精細化工有限公司；

丁香酚標準品：上海源葉生物科技有限公司；

冰醋酸：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

溴化鉀：光譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

傅里葉紅外儀：Vertex 70型，德國布魯克科技有限公司；

掃描電鏡：TM3030Plus型，日本日立公司；

差示掃描量熱儀：DSC3型，瑞士梅特勒—托利多集團；

紫外可見光分光光度計：UV2800型，上海尤尼柯儀器有限公司；

激光粒度儀：MS2000型，英國馬爾文儀器有限公司；

微量高速臺式離心機：TG16-W型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：85-2型，常州越新儀器制造有限公司；

臺式pH計：雷磁PHS-3E型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-10D型，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；

超聲清洗機：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的制備 參照Woranuch等[23]的方法，稍加改進，采用離子凝膠法制備丁香精油—殼聚糖納米膠囊。將殼聚糖溶于1%冰醋酸中，制成5 mg/mL的殼聚糖溶液，60 ℃磁力攪拌60 min后采用0.45 μm微孔濾紙過濾，用2 mol/L 氫氧化鈉調節(jié)濾液pH值。取50 mL上述殼聚糖溶液加入與丁香精油相同質量的吐溫-80，60 ℃攪拌30 min得到均勻混合物冷卻至常溫備用。丁香精油溶于無水乙醇，將精油溶液加入殼聚糖溶液中，常溫攪拌30 min。將多聚磷酸鈉溶液(調節(jié)pH值使其與殼聚糖溶液一致)逐滴加入到精油—殼聚糖乳化液中，常溫攪拌60 min，形成丁香精油—殼聚糖納米膠囊分散液，經(jīng)12 000 r/min離心20 min，納米膠囊懸浮于蒸餾水中，經(jīng)15 Pa凍干24 h用于進一步分析。

1.3.2 單因素試驗

(1) 殼聚糖溶液pH值對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響：采用1.3.1的制備方法，分別將殼聚糖溶液pH值調節(jié)為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比為3∶1，丁香精油與殼聚糖質量比為0.8∶1.0。

(2) 殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響：采用1.3.1的制備方法，殼聚糖溶液pH值為4.5，殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比分別為3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，丁香精油與殼聚糖質量比為0.8∶1.0。

(3) 丁香精油與殼聚糖質量比對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響：采用1.3.1的制備方法，殼聚糖溶液pH值為4.5，殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比為5∶1，丁香精油與殼聚糖質量比分別為0.4∶1.0，0.6∶1.0，0.8∶1.0，1.0∶1.0，1.2∶1.0。

1.3.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結果，選取殼聚糖溶液pH值、殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比、丁香精油與殼聚糖質量比為主要影響因素，利用DPS 7.05軟件，以膠囊粒徑和包埋率為考察指標，設計三因素三水平正交試驗，確定最佳制備工藝。

1.3.4 丁香精油—殼聚糖納米膠囊包埋率的測定 參照文獻[24-25]方法，稍加改進，納米膠囊分散液經(jīng)過12 000 r/min 離心20 min后除去上清液，經(jīng)去離子水沖洗后將其分散于50 mL無水乙醇中，經(jīng)25 ℃、500 W超聲30 min使納米膠囊壁材破碎，其中所包埋的丁香精油溶于無水乙醇中，測定282 nm波長處的吸光度，根據(jù)丁香酚紫外標準曲線方程計算出納米膠囊中包埋丁香酚的質量，由丁香酚質量算出納米膠囊中包埋丁香精油的總質量，按式(1)計算包埋率。

(1)

式中：

E——包埋率，%；

ML——包埋丁香精油總質量，mg；

M——加入丁香精油總質量，mg。

1.3.5 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的粒徑分布檢測 使用純凈水作為背景，測定背景后加入膠囊分散液使溶液充分混合，控制其濃度在可測試范圍內，通過激光粒度分析儀測定膠囊粒徑大小和分布狀況[26]。

1.3.6 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的掃描電鏡觀察 將制備好的膠囊樣品溶液均勻滴在黑色導電膠上晾干，放入儀器樣品臺上，通過掃描電鏡對膠囊的形態(tài)進行觀察[27]。

1.3.7 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的傅里葉紅外光譜分析 使用溴化鉀作為背景，樣品研磨后壓制成透明薄片，放入傅里葉紅外儀中進行紅外掃描。儀器參數(shù)：光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4 cm-1[28]。

1.3.8 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的差示掃描量熱儀分析 以殼聚糖、丁香精油、空白膠囊凍干粉和膠囊凍干粉為樣品，放入樣品臺檢測。儀器參數(shù)：升溫速率15 ℃/min，測定溫度區(qū)間30～450 ℃，保護氣選擇氮氣，氮氣流速為100 mL/min[29]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)取3次平行試驗的平均值，用Excel 2010以及DPS 7.05對試驗數(shù)據(jù)進行處理(顯著水平P<0.05)，用Origin pro 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖溶液pH值對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響

圖1 殼聚糖溶液pH值對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響

Figure 1 Effect of pH value of chitosan solution on particle size and entrapment efficiency of chitosan-clove essential oil-loaded nanocapsules

2.2 殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響

圖2 殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響

Figure 2 Effects of mass ratio of chitosan to sodium tripolyphosphate on particle size and entrapment efficiency of chitosan-clove essential oil-loaded nanocapsules

2.3 殼聚糖與丁香精油質量比對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響

由圖3可知，隨著丁香精油添加量的增加，納米膠囊粒徑逐漸增大，包埋率先升高后略有下降。這是因為當精油含量較少時，丁香精油形成極為細小的液滴分散于溶液中，殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯(lián)形成囊壁時包裹精油量較少，導致膠囊粒徑較小[34]；隨著精油添加量的增加，精油液滴之間相互碰撞發(fā)生凝聚致使精油液滴粒徑增大，殼聚糖對大粒徑精油液滴表面進行包裹使得膠囊粒徑增大[32]36。當丁香精油與殼聚糖質量比高于0.8∶1.0時，納米膠囊粒徑繼續(xù)增大，但包埋率卻出現(xiàn)下降趨勢，這主要是由于精油濃度增加，單位體積內大粒徑精油液滴相應增多，但形成囊壁的殼聚糖卻相對減少，囊壁也會越來越薄，甚至出現(xiàn)破裂致使精油滲出[35]，膠囊之間出現(xiàn)嚴重黏連[36]，導致膠囊粒徑增大包埋量卻有所降低。

圖3 丁香精油與殼聚糖質量比對丁香精油—殼聚糖納米膠囊粒徑以及包埋率的影響

Figure 3 Effect of mass ratio of clove essential oil to chitosan on particle size and entrapment efficiency of chitosan-clove essential oil-loaded nanocapsules

2.4 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平正交試驗對納米膠囊制備工藝進行優(yōu)化，其試驗設計方案及考察因素水平見表1。

表1 正交試驗設計因素與水平

由表2可知，各因素對膠囊粒徑影響的主次順序為A>C>B，由膠囊粒徑越小越好得到粒徑最優(yōu)組合為A2B1C1；各因素對膠囊包埋率影響的主次順序為C>B>A，由包埋率越大越好得到包埋率最優(yōu)組合A1B3C3。由表3可知，殼聚糖溶液pH值對膠囊粒徑影響顯著(P<0.05)，丁香精油與殼聚糖質量比對膠囊粒徑影響最小，為得到較小粒徑應選擇A2為最佳制備水平之一。由表4可知，丁香精油與殼聚糖質量比對膠囊包埋率影響顯著(P<0.05)，殼聚糖溶液pH值對膠囊包埋率影響最小，為得到較大包埋率應選擇C3為最佳制備水平之一。殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比對粒徑及包埋率影響皆不顯著，為得到較大包埋率應選擇B3為最佳制備水平之一。綜上所述，為了得到粒徑較小包埋率較大的精油膠囊，選擇最佳組合A2B3C3，即殼聚糖溶液pH值4.5、殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比5∶1、丁香精油與殼聚糖質量比0.8∶1.0，此條件下制得膠囊粒徑為175 nm，包埋率為40.2%，用于下一步表征分析。

2.5 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的粒徑分布及形態(tài)觀察

由圖4可以看出，空白膠囊和丁香精油—殼聚糖納米膠囊均呈現(xiàn)雙峰分布，其平均粒徑分別為128 nm和175 nm；空白膠囊和丁香精油—殼聚糖納米膠囊都在448 nm 處出現(xiàn)第二峰，這是由于部分膠囊相互凝聚導致較大顆粒的粒徑分布增強，且丁香精油—殼聚糖納米膠囊在448 nm處的粒徑分布強度強于空白殼聚糖納米膠囊，可能是膠囊表面殘留的游離芯材加重了膠囊間的凝聚。圖5表明，丁香精油—殼聚糖納米膠囊為球形顆粒，形態(tài)飽滿，顆粒之間相互接觸緊密，部分膠囊相互黏連，與粒徑分析結果一致。徐俊等[37]研究緩釋型驅蚊納米膠囊的制備，經(jīng)電鏡掃描后觀察到球狀納米顆粒有團聚現(xiàn)象，與本研究結果一致。

表2 粒徑正交試驗設計與結果

表3 粒徑方差分析

表4 包埋率方差分析

圖4 丁香精油—殼聚糖納米膠囊與空白殼聚糖納米膠囊的粒徑分布

Figure 4 Particle size distribution of chitosan nanoparticles and chitosan-clove essential oil-loaded nanocapsules

圖5 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的掃描電鏡圖

2.6 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的傅里葉紅外光譜分析

由圖6可知，殼聚糖在2 876 cm-1出現(xiàn)C—H伸縮振動吸收峰，1 657 cm-1出現(xiàn)酰胺Ⅰ帶的C═O伸縮振動吸收峰，1 598 cm-1出現(xiàn)N—H彎曲振動吸收峰，1 424 cm-1出現(xiàn)C—N對稱伸縮振動吸收峰，1 093 cm-1出現(xiàn)—CH3對稱變形振動以及C—O骨架振動吸收峰?？瞻啄z囊中伯胺基與仲胺基的吸收峰發(fā)生藍移向短波移動至1 642 cm-1和1 547 cm-1，這是由于三聚磷酸鈉中的磷酸基團與殼聚糖中的氨基在靜電作用下結合。陶武等[38]采用傅里葉紅外光譜研究殼聚糖包埋山梨酸鈉微膠囊的結構變化，結果也出現(xiàn)伯、仲胺基藍移的情況。丁香精油的紅外圖譜出現(xiàn)大量吸收峰，表明其中存在多種揮發(fā)性化合物，在2 930 cm-1出現(xiàn)C—H不對稱伸縮振動吸收峰，2 855 cm-1出現(xiàn)C—H對稱伸縮振動吸收峰；1 742 cm-1出現(xiàn)酰胺I帶的C═O伸縮振動吸收峰[39]，1 513 cm-1出現(xiàn)芳香族C═C伸縮振動吸收峰。與空白膠囊相比，丁香精油—殼聚糖納米膠囊在2 925 cm-1與2 862 cm-1處出現(xiàn)明顯增強的C—H伸縮振動吸收峰，并在1 736 cm-1處出現(xiàn)一個新峰，為酰胺I帶的C═O伸縮振動吸收峰，表明丁香精油已被成功包埋到殼聚糖與三聚磷酸鈉形成的納米膠囊中。

a. 殼聚糖粉 b. 空白膠囊 c. 丁香精油 d. 精油膠囊

2.7 丁香精油—殼聚糖納米膠囊的差示掃描量熱儀分析

由圖7可知，隨著溫度的升高，丁香精油揮發(fā)速度快速增加，溫度到達252 ℃出現(xiàn)吸熱峰，是由于精油沸騰汽化。純殼聚糖粉在99 ℃出現(xiàn)較寬吸熱峰，是由于殼聚糖親水基團吸附水的蒸發(fā)，在315 ℃出現(xiàn)尖銳放熱峰，是由于殼聚糖發(fā)生降解?？瞻啄z囊在252 ℃出現(xiàn)尖銳放熱峰，可能是由于殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯(lián)反應過程中發(fā)生能量變化導致降解放熱峰改變。廖霞等[36]對殼聚糖與海藻酸鈉復合物進行熱分析，結果表明殼聚糖與海藻酸鈉復合后峰位也出現(xiàn)向低溫偏移的情況。與空白膠囊相比，精油膠囊在252 ℃放熱峰減弱，可能是納米膠囊外層部分精油吸收了空白膠囊降解的部分熱量；與空白膠囊相比，精油膠囊在413 ℃出現(xiàn)吸熱峰，是由于中間產(chǎn)物進一步裂解碳化[40]，膠囊壁完全破裂精油發(fā)生汽化；與丁香精油相比，精油膠囊吸熱峰由252 ℃提高到413 ℃，說明殼聚糖對精油進行了包埋并對精油起到了一定的保護作用。

圖7 差示掃描量熱分析圖

3 結論

本研究采用離子凝膠法制備丁香精油-殼聚糖納米膠囊，通過正交試驗進行工藝優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：殼聚糖溶液pH值4.5、殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比5∶1、丁香精油與殼聚糖質量比0.8∶1.0，此條件下制得納米膠囊包埋率達到40.2%，膠囊平均粒徑為175 nm。丁香精油—殼聚糖納米膠囊外觀呈球形，形態(tài)飽滿，且具有良好的熱穩(wěn)定性。將所制備納米膠囊應用于食品保鮮中，研究其對食品貯藏期間品質的影響仍需進一步探討。