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    秀珍菇鮮味菇液酶解制備工藝優(yōu)化

    2019-07-09 00:54:20方若思吳安琰顧宇婷陳咨豪項雅麗楚秉泉肖功年劉士旺龔金炎
    食品與機(jī)械 2019年6期
    關(guān)鍵詞:珍菇鮮菇樹花

    方若思 吳安琰 顧宇婷 陳咨豪 李 堅 項雅麗 楚秉泉 肖功年 劉士旺 龔金炎

    (1. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 杭州 310023;2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點試驗室,浙江 杭州 310023;3. 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310023)

    食用菌含有豐富的氨基酸等呈味物質(zhì),鮮味獨特,因此調(diào)味料開發(fā)是其深加工的重要方向。國內(nèi)外采用食用菌提取物提味增鮮,但工藝簡單,食用菌來源單一[1]。秀珍菇脂肪含量較低,蛋白質(zhì)含量豐富,氨基酸種類齊全,其中必需氨基酸含量在35%以上[2-3],還含有活性多糖、黃酮等成分[4-6]。但關(guān)于酶解法提取秀珍菇有效成分的工藝研究較少,陳雅平等[7]以氨基酸利用率為主要評價指標(biāo)酶解秀珍菇,通過單因素試驗和正交試驗,最佳酶解條件為復(fù)合風(fēng)味酶用量0.5%,酶解時間120 min,酶解溫度50 ℃,pH值8.5,秀珍菇氨基酸利用率為27.9%;李佳佳等[8]以秀珍菇干粉為原料,利用生物酶解和美拉德反應(yīng)技術(shù)制備具有菌菇特征風(fēng)味的調(diào)味核心基料,以還原糖含量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為指標(biāo),確定纖維素酶和中性蛋白酶的最佳酶解條件,在此條件下制備的秀珍菇酶解液水解度為13.75%。利用秀珍菇與其他菌類復(fù)配的食用菌調(diào)味菇液的研究則未見報道,國外研究主要集中在秀珍菇的主要功能及相關(guān)生物活性、營養(yǎng)成分的鑒定分離純化及開發(fā)等方面[8-9];而國內(nèi)研究則主要集中在生物學(xué)特性、褐變保鮮、功能成分提取及活性等方面[10-11]。

    海鮮菇是一種藥食兩用的珍稀菌[12-13],氨基酸含量豐富,含有對人體有益的黃酮和酚類等營養(yǎng)成分,具有抗炎癥、抗氧化等功能[14-16]。香菇營養(yǎng)豐富,含有如多糖、香菇嘌呤、氨基酸等多種有效成分,香菇多糖的抗病毒,抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫功能突出[17]?;覙浠ㄎ兜栗r美,營養(yǎng)豐富,抗腫瘤多糖、多酚、酮類和甾類的含量可觀,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、平衡營養(yǎng)成分等特殊藥理作用[18-19]。

    為均衡營養(yǎng)、提高活性成分含量,協(xié)調(diào)不同食用菌的功能,本試驗擬以秀珍菇為主要原料,輔以海鮮菇、香菇和灰樹花3種食用菌,探索不同配比的食用菌在纖維素酶和蛋白酶復(fù)配的酶解條件下,優(yōu)化制取高氨基酸含量的食用菌調(diào)味菇液的工藝條件,以期為秀珍菇等食用菌綜合開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 原料

    秀珍菇、海鮮菇、香菇、灰樹花:縉云縣珍稀食用菌專業(yè)合作社提供;

    秀珍菇、海鮮菇、香菇、灰樹花在50~70 ℃下烘干8 h、磨成粉末,裝在封口袋中放置于陰涼干燥處保存。

    1.1.2 試劑

    抗壞血酸:生物試劑,純度>98%,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心;

    茚三酮:生物試劑,純度>98%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    醋酸、正丙醇、正丁醇、乙二醇:分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;

    硫酸:分析純,衢州巨化試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    高速離心機(jī):TG18K型,長沙東旺實驗儀器有限公司;

    高速多功能粉碎機(jī):RHP-600型,浙江榮浩工貿(mào)有限公司;

    凱氏定氮儀:UDK 159型,上海人和科學(xué)儀器有限公司;

    電熱鼓風(fēng)干燥箱:GZX-9076 MBE型,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;

    紫外可見分光光度計:UV 5500PC型,上海元析儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 工藝流程

    各食用菌按比例混合→加水溶解→調(diào)節(jié)pH→纖維素酶酶解4 h→調(diào)節(jié)pH→蛋白酶酶解→滅酶→離心→鮮味菇液

    1.3.2 食用菌蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法。參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》,采用VELP UDK159自動定氮儀測定。

    1.3.3 酶解工藝的優(yōu)化

    (1) 食用菌配伍比例:取3.333 g(料液比1∶15 g/mL)不同食用菌配伍比(見表1)食用菌干粉,加入50 mL去離子水充分溶解,調(diào)節(jié)pH至5.0,加入0.04%纖維素酶,搖勻,于50 ℃水浴酶解4 h,調(diào)節(jié)pH至7.0,加入0.1% 蛋白酶,搖勻,再置于50 ℃水浴酶解5 h。酶解結(jié)束后,水解液在100 ℃下加熱滅酶10 min,7 000 r/min離心15 min,取適量上清液20倍稀釋后備用。

    表1 食用菌配伍質(zhì)量比例

    (2) 料液比:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,以料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25 (g/mL),按1.3.2(1)所示方法,考察料液比對水解度的影響。

    (3) 蛋白酶酶解溫度:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,按1.3.2(1)所示方法,加入蛋白酶搖勻后,分別于30,35,40,45,50,55 ℃ 的水浴酶解5 h,考察蛋白酶酶解溫度對水解度的影響。

    (4) 蛋白酶酶解時間:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,按1.3.2(1)所示方法,加入蛋白酶搖勻后,分別于50 ℃水浴酶解0.5,1.0,3.0,5.0,7.0 h,考察蛋白酶酶解時間對水解度的影響。

    (5) 纖維素酶酶解pH值:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,分別調(diào)節(jié)纖維素酶酶解pH至4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,按1.3.2(1)所示方法,考察纖維素酶酶解pH值對水解度的影響。

    (6) 蛋白酶酶解pH值:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,加入50 mL去離子水充分溶解,調(diào)節(jié)pH至5.0,加入0.021 3 g 纖維素酶,搖勻,于50 ℃水浴酶解4 h,分別調(diào)解pH至6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,加入0.053 3 g蛋白酶,搖勻,于50 ℃水浴酶解5 h。隨后加熱滅酶并離心,取適量上清液20倍稀釋后備用。

    (7) 纖維素酶添加量:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,按1.3.2(1)所示方法,分別加入0.02%,0.04%,0.10%,0.20%,0.40% 纖維素酶,考察纖維素酶添加量對水解度的影響。

    (8) 蛋白酶添加量:取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉,按1.3.2(1)所示方法,分別加入0.02%,0.04%,0.10%,0.20%,0.40% 蛋白酶,搖勻,考察蛋白酶添加量對水解度的影響。

    1.3.4 測定項目及方法

    (1) 游離α-氨基態(tài)氮測定:取待測液1.0 mL,去離子水1mL,水合茚三酮3.0 mL(0.6 g重結(jié)晶的茚三酮用15 mL 正丙醇、30 mL正丁醇、60 mL乙二醇及9 mL pH 4.54的醋酸鹽緩沖液溶解),0.1%抗壞血酸溶液0.1 mL,混勻,封口。沸水浴加熱15 min后冷卻,加入14.9 mL的60%乙醇溶液,搖勻,于570 nm測定吸光度。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取5 μg/mL精氨酸氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL至6個25 mL容量瓶中,分別加水補(bǔ)充至2.0 mL,加水合茚三酮3.0 mL,加抗壞血酸溶液0.1 mL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%),混勻,封口,在沸水浴中加熱15 min,取出用冷水快速冷卻至室溫,定容,搖勻,靜置15 min,加入14.9 mL的60%乙醇溶液,搖勻,于570 nm波長下,以空白試劑為參比測定各溶液吸光度A,以氨基酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    (2) 水解度的測定:水解度指游離α-氨基態(tài)氮占總氮的百分比,按式(1)計算:

    (1)

    式中:

    c——水解度,%;

    m1——游離α-氨基態(tài)氮質(zhì)量,g;

    m2——總氮質(zhì)量,g。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 食用菌蛋白質(zhì)含量測定

    由表2可知:秀珍菇蛋白質(zhì)含量(19.958 g/100 g)最高,其次為灰樹花(蛋白質(zhì)含量約14.128 g/100 g),再次為海鮮菇(蛋白質(zhì)含量為12.852 g/100 g),香菇蛋白質(zhì)含量最低(12.719 g/100 g)。因此,選擇以秀珍菇為主要原料,配合香菇、海鮮菇和灰樹花的食用菌干粉為研究對象。

    2.2 游離α-氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    以精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=0.037 3x-0.009 3,相關(guān)系數(shù)為R2=0.989 9,結(jié)果如圖1所示。

    表2 各菌菇的含氮量及蛋白質(zhì)含量(干基)

    圖1 α-氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 單因素最佳酶解條件確定

    2.2.1 食用菌配伍比例對水解度的影響 蛋白質(zhì)含量高的菌菇,其組分含量越高,水解度就越大,秀珍菇的蛋白質(zhì)含量最大。由圖2可以看出:隨著秀珍菇組分含量的升高,水解度增大,秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花=6.0∶3.0∶0.5∶0.5時,水解度達(dá)到最大值為16.987%,此時氨基酸占總氮含量的比重最大,說明在該條件下,酶解產(chǎn)生的游離氨基酸含量最高。因此,確定該配比為最佳配比。

    圖2 組分比對水解度的影響

    2.2.2 料液比對水解度的影響 由圖3可知:當(dāng)料液比為1∶15(g/mL)時,水解度達(dá)到最大值為16.463%,此時氨基酸占總氮含量的比重最大,說明在該條件下,酶解產(chǎn)生的游離氨基酸含量最高。因此,確定該料液比為最佳。

    2.2.3 蛋白酶酶解溫度對水解度的影響 蛋白酶酶解溫度是影響蛋白酶活性的重要因素。如圖4所示,在30~40 ℃時水解度隨著溫度的升高而大幅增大,溫度達(dá)到40 ℃ 時樣品蛋白質(zhì)的水解度達(dá)到最大值17.939%,當(dāng)溫度從40 ℃繼續(xù)上升到60 ℃時水解度逐漸下降,酶解溫度對水解度的影響較大。因此,選定40 ℃為蛋白酶酶解的最適溫度,進(jìn)入下一步試驗。

    圖3 料液比對水解度的影響

    圖4 蛋白酶酶解溫度對水解度的影響

    2.2.4 蛋白酶酶解時間對水解度的影響 由圖5可知,酶解0.5~5.0 h時,隨時間的延長,水解度逐漸增大,且在3~5 h時增幅最大,酶解5 h后增幅減緩。故后續(xù)試驗選擇蛋白酶酶解時間為5 h。

    2.2.5 纖維素酶酶解pH值對水解度的影響 pH值可影響底物和纖維素酶的穩(wěn)定性。由圖6可知:隨著pH的增大,水解度逐漸增大,當(dāng)pH達(dá)到5.5時水解度達(dá)到最大值17.470%,之后水解度呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。因此,選擇纖維素酶酶解pH為5.5為最佳。

    圖5 蛋白酶酶解時間對水解度的影響

    圖6 纖維素酶酶解pH值對水解度的影響

    2.2.6 蛋白酶酶解pH值對水解度的影響 由圖7可知,隨著pH的增大,水解度逐漸增大,當(dāng)pH達(dá)到7.5時水解度達(dá)到最大值,之后水解度呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。因此,后續(xù)試驗選擇蛋白酶酶解pH為7.5。

    圖7 蛋白酶酶解pH值對水解度的影響

    2.2.7 纖維素酶添加量對水解度的影響 如圖8所示,當(dāng)?shù)孜锖枯^高時,酶促反應(yīng)速度與酶含量呈正比,纖維素酶添加量在0.02%~0.10%時,水解度大幅增加,而在0.10%~0.40%時水解度有減小的趨勢,原因有兩個:① 當(dāng)酶添加量達(dá)到0.1%以后,水解產(chǎn)生的產(chǎn)物可能對酶活有抑制作用;② 大部分底物已被反應(yīng)消耗。所以最適纖維素酶添加量為0.10%。

    圖8 纖維素酶添加量對水解度的影響

    2.2.8 蛋白酶添加量對水解度的影響 從圖9可以看出:當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繌?.02%增加到0.10%時,酶促反應(yīng)速率大大增加,水解度大幅增加。當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繌?.10% 增加到0.40%時,雖然酶促反應(yīng)速率繼續(xù)增大,但底物物料有限,幾乎被完全水解,所以水解度趨于平穩(wěn)。因此,選擇0.10%為最適蛋白酶添加量。

    圖9 蛋白酶添加量對水解度的影響

    2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳酶解工藝

    2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取對水解度影響較大的蛋白酶酶解溫度、纖維素酶添加量和蛋白酶酶解pH值等3個影響因子,其他因素選取單因素試驗最佳條件,采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法進(jìn)行酶解條件的優(yōu)化,其因素水平編碼見表3,試驗因素與水平設(shè)計見表4。軟件分析得到水解度對以上3個因素的二次多項回歸模型為:

    DH=-437.710 18+5.471 63A+31.909 13B+93.122 27C+0.959 53AB-0.044 06AC+5.580 96BC-0.062 499A2-505.540 58B2-6.298 88C2。

    (2)

    2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 由圖9可以看出,隨著纖維素酶量從0.05%增加到0.11%和蛋白酶酶解溫度從35 ℃ 上升到42 ℃的過程中,水解度上升變化明顯;繼續(xù)提高纖維素酶添加量和蛋白酶酶解溫度,水解度開始下降。結(jié)合等高線圖可以得出,等高線中的最小橢圓的中心點即是響應(yīng)面的最高點,等高線形狀呈橢圓形,表示A和B兩因素交互作用較顯著。由圖10可以得出,蛋白酶酶解溫度和蛋白酶pH值曲線坡度大,說明這兩個因素對水解度的影響變化很快。隨著蛋白酶酶解溫度從35 ℃上升到42 ℃和蛋白酶pH值從7.0上升到7.4的過程中,水解度上升變化明顯;繼續(xù)提高蛋白酶酶解溫度,水解度上升變化不明顯;而繼續(xù)提高蛋白酶pH值,水解度急劇下降,表明蛋白酶對pH變化較敏感且其最適宜pH為7.2~7.4。結(jié)合等高線圖可以得出,等高線中的最小橢圓的中心點即是響應(yīng)面的最高點,等高線形狀呈橢圓形,表示A和C兩因素交互作用較顯著。由圖11以發(fā)現(xiàn),蛋白酶pH值曲線比纖維素酶添加量曲線變化更大,說明蛋白酶pH值對水解度的影響更為顯著。隨著纖維素酶添加量從0.05% 上升到0.11%和蛋白酶pH值從7.0上升到7.4的過程中,水解度平穩(wěn)上升;繼續(xù)提高纖維素酶添加量和蛋白酶pH值,水解度呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)合等高線圖可以發(fā)現(xiàn),等高線圖形呈明顯的橢圓形,表明B和C兩因素交互作用顯著。

    表3 因素水平編碼表

    表4纖維素酶和蛋白酶酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化方案與結(jié)果

    Table4Responsesurfaceoptimizationschemeandresultsofcellulaseandneutralproteasehydrolysisconditions

    組別ABCDH/%100018.416200017.802300018.357410-117.6825-1-1014.382601114.745710115.3918-11014.56890-1-116.262100-1112.9231101-117.5251211016.85013-10112.6691400018.5341500017.90216-10-114.519171-1015.704

    表5 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果?

    圖10 蛋白酶酶解溫度和纖維素酶添加量對水解度的影響

    圖11 蛋白酶酶解溫度和酶解pH值對水解度的影響

    圖12 纖維素酶添加量和蛋白酶酶解pH值對水解度的影響

    結(jié)合P值可知:模型的一次項A和C極顯著,二次項A2和C2極顯著,B2顯著表明各因素對水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系。該模型下得到最佳工藝參數(shù)為蛋白酶酶解溫度42.06 ℃、蛋白酶pH 7.29、纖維素酶添加量0.11%,此時水解度為18.775%。結(jié)合實際,調(diào)整各因素為蛋白酶酶解溫度42 ℃、蛋白酶pH 7.30、纖維素酶添加量0.10%,此時水解度為18.510%,與預(yù)測值相差為1.41%,證明了該模型的可靠性。

    3 結(jié)論

    本試驗結(jié)果表明,制取高氨基酸含量的最優(yōu)酶解工藝條件為蛋白酶酶解溫度42 ℃、蛋白酶pH 7.30、纖維素酶添加量0.10%,此時水解度為18.510%。

    多種食用菌復(fù)配結(jié)合制備鮮菇菌液的方式,不僅有利于協(xié)調(diào)不同食用菌的氨基酸,同時可以增加產(chǎn)品的功能性,為開發(fā)秀珍菇等食用菌深加工產(chǎn)品提供新思路,但是本研究還存在一些不足,雖然水解度比單一采用秀珍菇水解度高[19],但仍有提高空間,這可能與所選取的食用菌種類有關(guān),后續(xù)可以本研究作為基礎(chǔ),開發(fā)更多秀珍菇及其他菌類復(fù)合的深加工產(chǎn)品,提高氨基酸利用率,增進(jìn)營養(yǎng)和保健功能。同時,進(jìn)行單一菌菇酶解制備菇液,得到鮮味液體在氣味上尚有不足;如果通過添加部分還原糖,進(jìn)行美拉德反應(yīng),就能夠滿足氣味上的要求。

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