羅格列酮保護(hù)氧糖剝奪復(fù)氧PC12細(xì)胞通過減少HMGB1釋放和上調(diào)DUSP8

王 莉，張美杰，李文靜，毛森林，劉美玲，黃 山，蔡靈鈺，俞春江

研究證實(shí)PPARγ受體激動(dòng)劑在腦缺血再灌注損傷、帕金森病和肌萎縮側(cè)索硬化等模型中減少神經(jīng)元凋亡[1～5]，但PPARγ在缺血性腦損傷的具體機(jī)制尚不明確。炎性細(xì)胞分泌HMGB1，在腦缺血再灌注損傷中具有啟動(dòng)與放大免疫反應(yīng)的作用，PPARγ受體激動(dòng)劑可減少HMGB1釋放[6]。近年報(bào)道PPARγ抗凋亡可能與雙特異性蛋白磷酸酶有關(guān)[7]。研究表明MAPK信號(hào)通路參與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡，雙特異性蛋白磷酸酶使MAPK通路重要成員去磷酸化，發(fā)揮抗凋亡作用[7]。因此，我們推測PPARγ受體激動(dòng)劑可能減少HMGB1分泌，并上調(diào)雙特異性蛋白磷酸酶8，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究采用氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧PC12細(xì)胞模型，觀察羅格列酮干預(yù)后的PPARγ、RAGE、HMGB1、DUSP8、Bcl-xl等指標(biāo)變化，探討羅格列酮對缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 PC12細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于5% CO237 ℃溫箱培養(yǎng)。培養(yǎng)液每2 d更換一次，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶壁70%～80%，按照1∶4的比例傳代。分組：(1)正常對照組：正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞；(2)溶劑對照組(vehicle 組)： 含0.1%DMSO的培養(yǎng)液處理的PC12細(xì)胞；(3)OGD10 h/R24 h組：PC12細(xì)胞氧葡萄糖剝奪10 h/復(fù)氧24 h；(4)OGD10 h/R24 h+RGZ組：OGD10 h后復(fù)氧時(shí)給予RGZ作用于PC12細(xì)胞24 h；(5)OGD10 h/R24 h+RGZ+GW9662組：OGD10 h后復(fù)氧時(shí)給予RGZ和GW9662作用于PC12細(xì)胞24 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2 主要試劑和儀器 大鼠HMGB1 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；多克隆兔抗鼠PPARγ 抗體(Santa Cruz公司)，多克隆兔源抗DUSP8抗體(ORIGENE公司，美國)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；PPARγ 激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone,RGZ)；PPARγ 拮抗劑 GW9662 均購自 Cayman Chemical 公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680，美國)；倒置相差顯微鏡(Nikon TS100，日本)。

1.3 OGD/R模型建立 將PC12細(xì)胞按照2×104/ml密度接種于96孔板，每孔加入培養(yǎng)液約100 μl，置5% CO2培養(yǎng)箱24 h。待細(xì)胞貼壁后，將對照組培養(yǎng)基更換為含糖Earle’s平衡鹽溶液繼續(xù)培養(yǎng)；用無糖Earle’s平衡鹽溶液替換實(shí)驗(yàn)組的完全培養(yǎng)基，將實(shí)驗(yàn)組放入37 ℃，含95% N2、5% CO2混合氣體的培養(yǎng)箱10 h后，將對照組和實(shí)驗(yàn)組更換為完全培養(yǎng)基，再置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h以及48 h模擬不同的再灌注時(shí)間。

1.4 細(xì)胞存活率檢測 將PC12細(xì)胞接種在96孔板中，并通過四基甲偶氮唑藍(lán)(MTT)測定細(xì)胞活力。PC12細(xì)胞OGD10 h后分別復(fù)氧6 h、12 h、24 h、48 h后，在常規(guī)培養(yǎng)基中于37 ℃與MTT(100 μg/ml)一起溫育。4 h后洗滌細(xì)胞，然后加入100 μl二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶聯(lián)免疫吸附測定儀，在570 nm監(jiān)測產(chǎn)物形成。

1.5 Western blot檢測PPARγ、RAGE和DUSP 8及 Bcl-xl蛋白表達(dá)水平 吸棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌兩次，將細(xì)胞移入1 ml離心管，4 ℃下2000 rpm離心5 mim，棄上清，在離心沉淀的細(xì)胞碎片內(nèi)加入150 μl細(xì)胞裂解液及1.5 μl蛋白酶抑制劑(PMSF)混勻后于冰上裂解30 min，4 ℃下12000 rpm離心30 min，取上清液移至EP管-80 ℃保存。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下封閉1 h，分別加入1∶500稀釋的單克隆兔抗鼠PPARγ一抗(美國Santa Cruz，sc-73554)；1∶500稀釋的多克隆兔抗鼠DUSP8一抗(ORIGENE公司，美國，TA322744)，4 ℃孵育過夜；分別加入1∶3000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB2301)，室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的分子量和凈光密度值。

1.6 ELISA法檢測HMGB1水平 取各組細(xì)胞上清液 40 μl，按照說明書步驟操作，在波長為 450 nm下測量標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HMGB1含量。

2 結(jié) 果

2.1 建立OGD/R細(xì)胞損傷模型 PC12細(xì)胞經(jīng)缺氧低糖處理10 h后，經(jīng)不同復(fù)氧時(shí)間6～48 h后，測定細(xì)胞存活率。PC12細(xì)胞缺氧低糖處理10 h后，其存活率隨再灌注時(shí)間延長而降低，細(xì)胞存活率依次為(82.63±2)%、(66.17±3.82)%、(25.04±3.48)%、(24.44±0.17)%，同對照組相比差異明顯(P<0.01)。OGD10 h/R48 h組同OGD10 h/R24 h組相比較，無顯著差異(P>0.05)，故選擇OGD10 h/R24 h作為適宜的細(xì)胞損傷模型(見圖1A)。

2.2 羅格列酮和GW9662在OGD/R細(xì)胞模型中對細(xì)胞存活率影響

2.2.1 不同濃度羅格列酮對OGD/R處理后細(xì)胞存活率影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予不同濃度羅格列酮(0～15 μmol)作用24 h，檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示vehicle組與羅格列酮5 μmol組細(xì)胞生存率分別為(99.07±0.4)%、(101.07±4.55)%，同RGZ 0 μmol組相比無顯著性差異(P>0.05)；羅格列酮10 μmol和15 μmol組，細(xì)胞存活率分別為(148.56±6.1)%、(135.35±2.46)%，兩組相比無顯著差異(P>0.05)；羅格列酮10 μmol和15 μmol組，同RGZ 0 μmol組相比，細(xì)胞存活率明顯上升，差異均顯著(P<0.01)(見圖1B)。

2.2.2 不同濃度GW9662對羅格列酮作用的OGD/R處理后PC12細(xì)胞存活率的影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予10 μmol羅格列酮與不同濃度GW9662(0～15 μmol)作用24 h，測定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示GW9662濃度為10 μmol、15 μmol時(shí)，細(xì)胞生存率下降至(42.36±1.43)% 和(31.08±1.08)%，同RGZ10 μmol/GW9662 0 μmol組相比較，差異明顯(P<0.01)。RGZ 10 μmol/GW9662 15 μmol組與RGZ 10 μmol/GW9662 10 μmol組比較，無顯著差異(P>0.05)(見圖1C)。

2.3 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中對PPARγ受體的影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h，觀察其對PPARγ蛋白的影響。結(jié)果顯示，同對照組相比，PC12細(xì)胞經(jīng)過OGD10 h/R24 h處理后，PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)；同OGD10 h/R24 h組相比，羅格列酮治療組PPARγ蛋白表達(dá)水平上升(P<0.01)；而GW9662能夠下調(diào)羅格列酮引起的PPARγ蛋白表達(dá)上升，且同羅格列酮治療組相比較，GW9662組蛋白表達(dá)明顯下降(P< 0.01)(見圖2A)。

2.4 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中抗晚期炎癥反應(yīng)的作用

2.4.1 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中對HMGB1影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，測定細(xì)胞HMGB1分泌量。結(jié)果顯示，同對照組相比，PC12細(xì)胞經(jīng)過OGD10 h/R24 h處理后，HMGB1分泌量明顯上升(P<0.01)；羅格列酮組HMGB1分泌量下降55.9 %，差異顯著(P<0.01)，提示羅格列酮可以通過減少HMGB1而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。而加入GW9662后，HMGB1分泌量上升達(dá)59.8%，差異顯著(P<0.01)(見圖2B)。羅格列酮減少HMGB1釋放的效應(yīng)，被GW9662所阻斷，提示其作用機(jī)制經(jīng)由PPARγ受體介導(dǎo)。

2.4.2 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中對RAGE蛋白影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，檢測RAGE蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，OGD10 h/R24 h后，RAGE表達(dá)顯著增加，而經(jīng)過羅格列酮處理后，RAGE表達(dá)明顯下調(diào)，但羅格列酮這種作用可被GW9662所阻斷，表現(xiàn)為GW9662處理組RAGE蛋白表達(dá)顯著增加 (P<0.01)(見圖2C)，提示其作用機(jī)制經(jīng)由PPARγ受體介導(dǎo)。

2.5 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中抗凋亡作用

2.5.1 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中對DUSP8蛋白影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，檢測DUSP8表達(dá)情況。結(jié)果顯示，同對照組相比，OGD10 h/R24 h處理后，DUSP8表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)；羅格列酮干預(yù)后DUSP8表達(dá)水平明顯上升(P<0.01)；而GW9662能夠下調(diào)DUSP8表達(dá)上升，表現(xiàn)為GW9662處理組DUSP蛋白表達(dá)顯著降低 (P<0.01)(見圖3A)，提示羅格列酮引起DUSP8蛋白上調(diào)是經(jīng)由PPARγ受體介導(dǎo)的。

2.5.2 羅格列酮在OGD/R細(xì)胞模型中對Bcl-xl蛋白影響 PC12細(xì)胞OGD10 h后，復(fù)氧時(shí)給予10 μmol羅格列酮與15 μmol GW9662作用24 h后，檢測細(xì)胞Bcl-xl表達(dá)情況。結(jié)果顯示，同對照組比較，OGD10 h/R24 h處理后，Bcl-xl表達(dá)水平明顯下降 (P<0.01)；羅格列酮組Bcl-xl表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)；而GW9662能夠下調(diào)羅格列酮引起的Bcl-xl表達(dá)上升，因此GW9662組的Bcl-xl表達(dá)明顯下降(P<0.01)(見圖3B)。說明羅格列酮引起的抗凋亡蛋白Bcl-xl上調(diào)是經(jīng)由PPARγ受體介導(dǎo)的。

A：不同再灌注時(shí)間對PC12細(xì)胞存活率影響；B：不同濃度羅格列酮和0.1%DMSO對OGD10 h/R24 h的PC12細(xì)胞存活率影響；C：不同濃度GW9662對10 μmol羅格列酮作用后OGD10 h/R24 h的PC12細(xì)胞存活率影響。與control組相比**P<0.01；與RGZ 0 μmol組相比**P<0.01；與RGZ10 μmol/GW9662 0 μmol組相比◆◆P<0.01

圖1 不同再灌注時(shí)間以及不同濃度羅格列酮和GW9662對PC12細(xì)胞存活率影響

A：PPARγ蛋白表達(dá)；B：HMGB1蛋白分泌情況；C：RAGE蛋白表達(dá)。與對照組相比較##P<0.01;與OGD10 h/R24 h組相比較**P<0.01；與OGD10 h/R24 h+10 μmol RGZ組相比較■■P<0.01

圖2 羅格列酮10 μmol、GW9662 15 μmol對OGD10 h/R24 h的PC12細(xì)胞的PPARγ、HMGB1以及RAGE蛋白表達(dá)的影響

A：對DUSP蛋白表達(dá)影響；B：對Bcl-xl蛋白表達(dá)影響。與對照組相比較**P<0.01;與OGD10 h/R24 h組相比較##P<0.01；與OGD10 h/R24 h+10 μmol RGZ組相比較■■P<0.01

圖3 羅格列酮10 μmol與GW9662 15 μmol對OGD10 h/R24 h處理的PC12細(xì)胞的DUSP8和Bcl-xl蛋白表達(dá)影響

4 討 論

近年來對缺血性腦卒中研究熱點(diǎn)集中于缺血再灌注損傷的具體機(jī)制，已證實(shí)PPARγ激動(dòng)劑能夠減輕缺血再灌注損傷、帕金森病及肌萎縮側(cè)索硬化等細(xì)胞模型的損傷，這為PPARγ激動(dòng)劑用于治療腦組織缺血再灌注損傷提供了充分研究基礎(chǔ)[8,9]。

有研究報(bào)道羅格列酮可以減輕缺血后的炎癥反應(yīng)，涉及IL-1、IL-6、TNF等炎性介質(zhì)[10]，本研究進(jìn)一步證實(shí)了羅格列酮可以通過減少HMGB1的釋放，而發(fā)揮減輕腦缺血再灌注后晚期炎癥反應(yīng)的效果[11]。HMGB1是一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，可由細(xì)胞直接破壞釋放，也可以由免疫細(xì)胞分泌。在細(xì)胞遷移和炎性反應(yīng)時(shí)，HMGB1是RAGE的生理性配體[12]。HMGB1/RAGE可通過激活核因子κB(NF-κB)促進(jìn)炎性反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[13]。研究報(bào)道PPARγ 激活可以調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE信號(hào)通路，在急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[14]。PPARγ是否可在神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷模型中，通過調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，國內(nèi)外缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮使氧糖剝奪神經(jīng)細(xì)胞RAGE表達(dá)下調(diào)，HMGB1分泌顯著下降，而PPARγ受體抑制劑GW9662可以逆轉(zhuǎn)該作用，提示羅格列酮通過PPARγ激活調(diào)控HMGB1分泌而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，并且可能通過調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，但其具體機(jī)制值得深入研究。

蛋白激酶是近期研究較多的靶點(diǎn)，應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)包括c-Jun N末端蛋白激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶，在腦缺血后被激活，抑制c-Jun N末端蛋白激酶或者p38絲裂原活化蛋白激酶，可以拮抗腦缺血后導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[15～17]。近年來已有研究證實(shí)防止細(xì)胞凋亡是噻唑烷二酮類對于腦缺血損傷后神經(jīng)保護(hù)的主要機(jī)制之一，羅格列酮通過下調(diào)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶而減少細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及JNK和p38激酶的磷酸化作用[7]。并且，相關(guān)研究集中探討蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(DUSPs)對于蛋白激酶磷酸化作用的調(diào)控[7]。DUSP8可以特定作用于JNK和p38，有研究報(bào)道羅格列酮對腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜕窠?jīng)細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，主要是通過促進(jìn)DUSP8上調(diào)，從而阻止JNK磷酸化激活作用實(shí)現(xiàn)的[7]。

在本研究中，我們證實(shí)了使用羅格列酮作用于OGD/R神經(jīng)細(xì)胞模型后， DUSP8蛋白和Bcl-xl表達(dá)均增加，而PPARγ受體抑制劑GW9662可以逆轉(zhuǎn)該作用。從而肯定了以羅格列酮為代表的PPARγ受體激動(dòng)劑通過上調(diào)DUSP8和Bcl-xl，對缺血和再灌注模型中神經(jīng)細(xì)胞的死亡起到保護(hù)作用。

綜上所述，我們證實(shí)了以羅格列酮為代表的PPARγ受體激動(dòng)劑在神經(jīng)細(xì)胞缺血和再灌注模型中可以通過減輕炎癥反應(yīng)和上調(diào)DUSP8發(fā)揮抗凋亡作用，而羅格列酮保護(hù)神經(jīng)元的作用可以被PPARγ受體抑制劑逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步證實(shí)其作用機(jī)制是通過PPARγ受體激活實(shí)現(xiàn)的。但本研究尚缺乏對于JNK信號(hào)通道的檢測，若能證實(shí)DUSP8蛋白升高，直接導(dǎo)致JNK磷酸化程度降低，從而減少細(xì)胞凋亡，則對于PPARγ受體激動(dòng)劑的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制，將提供更有力證據(jù)支持。因此，對于PPARγ受體激動(dòng)劑的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制的具體步驟，如對JNK信號(hào)通道的檢測等，尚待深入探討。