噬菌體裂解酶的應用概況

嚴晶 胡申才

摘要：近年來由于耐藥菌的頻頻出現(xiàn)，抗生素在抗感染領域面臨前所未有的挑戰(zhàn)，目前研制可裂解病原菌的噬菌體制劑已為一大熱點。噬菌體裂解酶是雙鏈DNA噬菌體在基因組復制晚期合成的一類蛋白質，它能夠水解細菌細胞壁中的肽聚糖從而殺滅細菌。噬菌體裂解酶在體內(nèi)外的試驗中都表現(xiàn)出很高的殺菌性、種屬特異性和安全性，因而具有廣闊的應用前景。簡要介紹了噬菌體裂解酶的結構性質，并對裂解酶顯示出的抗菌性能及應用進行了綜述。

關鍵詞：噬菌體;裂解酶;耐藥菌

中圖分類號：S562? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）10-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.10.001? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： More recently， the original application of phage as therapeutics to treat human and animal infections has been rekindled， particularly in an era where antibiotic resistance has become so problematic. Bacteriophage lysins，which are peptidoglycan hydrolases encoded by double-stranded DNA bacteriophage， are produced in phage-infected bacterial cells toward the end of the lytic cycle. It was proved that the phage lysins exhibited high activity against bacteria， narrow antibacterial spectrum， and apparent safety in vitro and vivo experiments. Those paved solid foundation for further exploration of their application. A review on the structure and mode of action of lysins and their application were presented.

Key words： bacteriophage; lysin; antibiotic resistant bacteria

噬菌體（Bacteriophage，phage）是能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[1]，據(jù)Brüssow[2]推算地球上大概有1032個噬菌體存在，這個數(shù)據(jù)大概是細菌數(shù)量的10倍?？梢哉f，凡是有細菌分布的地方， 就會有噬菌體存在。噬菌體感染的最后一步就是水解細菌細胞壁釋放成熟顆粒（絲狀噬菌體除外）。單鏈DNA噬菌體通過合成干擾宿主細菌肽聚糖合成的酶而導致宿主菌胞壁的水解，而雙鏈DNA噬菌體則可通過在復制晚期所合成的裂解酶（lysin或endolysin）來水解宿主菌的肽聚糖結構[3]。

1? 裂解酶的結構和溶菌機制

裂解酶又稱內(nèi)溶素、溶胞壁酶，是一類細胞壁水解酶。它被應用到體外時，可以快速使革蘭氏陽性菌裂解死亡[4]。多數(shù)噬菌體裂解酶具有“雙結構域結構”的特點：N端結構域具有催化活性，能夠特異地切斷肽聚糖中的化學鍵，稱為催化域CD。C端結構域可以識別和結合宿主細菌細胞壁上的特異性底物，稱為結合域CBD[5]。還有一些裂解酶（如大多數(shù)分枝桿菌噬菌體裂解酶） 含有多個不同的催化結構域和1個結合結構域。另外，金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Hyd H5擁有2個催化結構域，卻不含結合結構域[6]。而少數(shù)革蘭陰性菌噬菌體裂解酶N端為結合結構域，C端為催化結構域。因為裂解酶的作用位點是細菌細胞壁上的肽聚糖苷鍵，且為高度保守的肽聚糖成分，且隨著細菌進化，噬菌體也進化，使得細菌很難對裂解酶產(chǎn)生抗性[7]。

根據(jù)裂解酶催化結構域的作用位點，可粗略地將其分為胞壁酸酶（作用于胞壁上聚糖骨架中的β-1，4-糖苷鍵）、肽鏈內(nèi)切酶（作用于多肽鏈） 或酰胺酶（水解聚糖骨架和多肽鏈之間的酰胺鍵）[8]。還有一些裂解酶可以作用于其他位點，例如分枝桿菌噬菌體裂解酶Lysin B可以水解分枝菌酸和肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖復合物間的化學鍵[9]。

裂解酶從細菌內(nèi)部裂解細菌的方式稱為“自內(nèi)裂解”。將某些裂解酶加入到對其敏感的細菌中，在缺少噬菌體的情況下也能引起細菌裂解，則稱為“自外裂解”，也就是說，該類噬菌體裂解酶在細菌外也能發(fā)揮快速、高效的溶菌作用。

裂解酶的活性和結構特點顯示了其良好的抗菌作用，也使其在成為新型抗菌藥物方面擁有廣闊的前景。

2? 噬菌體裂解酶的優(yōu)勢

2.1? 不產(chǎn)生細菌抗性

基于相關抗菌藥物，如抗生素的缺點，耐藥性的超級細菌不斷進化對其產(chǎn)生抗性，使得藥物失效。在Nelson等[10]將化膿鏈球菌長時間暴露于含低濃度裂解酶的平板上，連續(xù)傳代40次也不會產(chǎn)生抗性。同樣，Loeffler等[11]將肺炎鏈球菌與低濃度裂解酶Pal混合，經(jīng)過液體培養(yǎng)基中的10次傳代，未出現(xiàn)抗性細菌。原理推測可能是Pal在肺炎鏈球菌上的作用位點是膽堿，膽堿對于肺炎鏈球菌的存活是必需的。推測噬菌體隨著細菌共同進化，為了裂解宿主后脫離宿主，裂解酶的結合結構域針對宿主細胞壁受體分子，經(jīng)演化后能夠特異性識別細菌并殺死細菌，使細菌很難對其產(chǎn)生耐受性。

2.2? 特異性介于抗生素和噬菌體之間

裂解酶的特異性相較于抗生素更好，相較于噬菌體，裂解譜又擴大了。研究發(fā)現(xiàn)，對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌菌株可以被裂解酶殺死，同時對人體的正常菌群沒有影響，而抗生素在殺死病原菌的同時，也損傷了部分正常菌群。不僅如此，裂解酶的裂解譜卻可以超出本身噬菌體的宿主譜，比如瑞士乳桿菌噬菌體Ф-0303的裂解酶Mur-LH[12]、無乳鏈球菌噬菌體B30的裂解酶和產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體Ф-3626的裂解酶Ply3626都可裂解多種同類細菌[13]。試驗證明，具有酰胺酶活性的裂解酶還具有更寬的裂解譜，可以裂解不同類的細菌。據(jù)報道，人類致病菌糞腸球菌噬菌體Ф1的裂解酶PlyV12可能是裂解譜最廣的，不但可以裂解同類腸球菌，如糞腸球菌和乳酸腸球菌，同時還可以裂解化膿鏈球菌、B群、C群鏈球菌和金黃色葡萄球菌等[14-17]。

2.3? 裂解酶刺激產(chǎn)生的相關抗體不會削弱其殺菌作用

由于裂解酶是較大的蛋白分子，在其通過動物體內(nèi)黏膜或經(jīng)注射進入全身循環(huán)時有可能刺激產(chǎn)生免疫反應從而影響自身作用的發(fā)揮。但Loeffler等[11]發(fā)現(xiàn)抗體的產(chǎn)生不會影響裂解酶自身的殺菌作用。Cpl-1裂解酶的體外試驗對肺炎鏈球菌作用的時候，產(chǎn)生的相關兔源高價免疫血清只會減緩不會阻礙其裂解作用。Cpl-1在小鼠體內(nèi)的半衰期很短，為20.5 min，這導致1～2次應用Cpl-1不能完全清除小鼠體內(nèi)的肺炎鏈球菌，之后感染會再次發(fā)生。在體內(nèi)試驗中，設置試驗組為Cpl-1 3次靜脈注射免疫的小鼠，對照組為未免疫的小鼠。用肺炎鏈球菌對小鼠靜脈攻毒10 h后再注入Cpl-1解毒，結果發(fā)現(xiàn)在1 min內(nèi)，試驗組和對照組都使細菌滴度降低了相同的程度。

Rashel等[18]在金黃色葡萄球菌的體內(nèi)試驗中，用裂解酶phiMR11也得到了相同的結論。推測是因為裂解酶與細菌細胞壁的親和力遠比與抗體的強，可以通過在動物黏膜表面或血液中重復注入裂解酶控制病原菌的定殖。還有研究顯示，對小鼠腹腔反復3次注射裂解酶MV-L以激活免疫反應，這樣會使其血清中的抗體水平大幅度上升，但抗體對裂解酶的影響有限。如，在體外試驗中，兔的高價免疫血清也只是對其活性產(chǎn)生一定限度的抑制;Rashel等[18]將金黃色葡萄球菌噬菌體？準MR11的裂解酶MV-L與鼠的免疫血清混合孵育1 h，也獲得了同樣的結論。Loessner等[19]的研究也顯示出當針對結合結構域的特異性IgG存在時，李斯特菌裂解酶的結合結構域仍會與細菌細胞壁上的底物結合，這表明裂解酶對底物的親和力高于其對抗體的親和力。雖然這能夠解釋抗體不能中和噬菌體的結合結構域，但無法解釋為何抗體無法中和催化結構域。

2.4? 裂解酶的作用高效迅速

裂解酶在體外與細菌接觸的瞬間迅速破裂細菌細胞，可使細菌濁度迅速下降[20]。對鏈球菌裂解酶ClyV的體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，25 μg/mL的裂解酶可以在15 min內(nèi)使靶細菌的數(shù)量下降2個數(shù)量級。裂解酶在加入渾濁的細菌溶液后，短時間內(nèi)以肉眼可見的速度下降其濁度。在細胞試驗中，將停乳鏈球菌與肺上皮細胞A549共孵育一段時間后，用PBS溶液洗去細胞表面黏附的鏈球菌，再加入有效工作濃度的ClyR進行處理。裂解細胞后，對細胞內(nèi)殘存的靶細胞進行稀釋平板計數(shù)，發(fā)現(xiàn)試驗組的細菌數(shù)量降低了2個數(shù)量級。在體內(nèi)試驗中，裂解酶同樣高效。盡管裂解酶在體內(nèi)的半衰期很短，如Cpl-1的半衰期只有16 min，但Loeffler等[11]發(fā)現(xiàn)將肺炎鏈球菌通過靜脈注射小鼠體內(nèi)攻毒1 h后，注入2.0 mg的Cpl-1可使小鼠存活48 h，其中有1只小鼠在血中和組織中的病原菌已經(jīng)消除。而對照組平均只能存活25 h，只有20%的小鼠可以存活48 h。短時間內(nèi)裂解酶在體內(nèi)外以及細胞胞內(nèi)都發(fā)揮了殺菌作用。

2.5? 裂解酶可與抗生素產(chǎn)生協(xié)同效應

2種酶共同使用可產(chǎn)生協(xié)同或競爭抑制作用。對裂解酶來說，無論是裂解酶之間或裂解酶與抗生素之間，都具有協(xié)同效應。Jado等[21]發(fā)現(xiàn)高濃度噬菌體Dp-1或高濃度裂解酶Cpl-1單獨使用，或低濃度Dp-1和低濃度Cpl-1共同使用，都可以使小鼠全部存活，而Dp-1或Cpl-1單獨使用時，因嚴重的菌血癥小鼠全部死亡。故低濃度的酶和噬菌體的混合物可以發(fā)揮與高濃度的單酶相同的效果，酶與噬菌體之間具有協(xié)同效應。裂解酶與抗生素聯(lián)用也可發(fā)揮協(xié)同殺菌作用。Djurkovic等[22]發(fā)現(xiàn)將裂解酶Cpl-1與慶大霉素聯(lián)用，可降低青霉素對肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）。當Cpl-1與青霉素聯(lián)用時，亦可以協(xié)同殺死對青霉素耐藥的菌株。Rashel[18]也證明了裂解酶與抗生素之間的協(xié)同效應，將金黃色葡萄球菌裂解酶MV-L與糖肽類抗生素聯(lián)用，很好地控制了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌的繁殖。裂解酶與抗生素的協(xié)同效應，為解決現(xiàn)階段愈加嚴重的細菌耐藥性問題提供了一種新思路。

3? 裂解酶的改造

由于裂解酶具有種屬特異性，且其結構域的特殊性使得酶的作用范圍受到局限，因此將裂解酶進行多功能設計，滿足廣譜性和性能的優(yōu)化。通過其結合結構域作用于細胞壁，水解細胞壁最終摧毀細胞，作用高效且不易產(chǎn)生抗性。根據(jù)裂解酶結構的模塊化，人們不但可以通過合成生物學合成有不同應用能力的裂解酶，如通過混合排列重組天然裂解酶的功能結構域來改變種屬特異性，提高廣譜裂解酶的殺菌活性和可溶性;而且還可以將不同源的結構域和肽端連接起來進行融合表達，如將減穩(wěn)肽和革蘭氏陰性菌的裂解酶融合表達，可以將其殺菌活性延伸到革蘭氏陰性菌。裂解酶及其他水解酶具有特殊的結構域，其作用方式及模塊都有所不同。如肺炎球菌噬菌體裂解酶的膽堿結構域發(fā)揮重要催化功能[23]，而金黃色葡萄球菌及乳球菌以細胞壁水解功能為主[24，25]，李斯特菌噬菌體裂解酶則以酰胺酶為主[26]。 雖然裂解酶因其結構功能的特性被分為不同類型，但其最根本還是以酰胺酶及內(nèi)肽酶為主要作用形式。在這些酶中，有一類常見的蛋白家族CHAP，在作為催化結構域時其表現(xiàn)為酰胺酶活性也會表現(xiàn)出內(nèi)肽酶的功能，在裂解過程中發(fā)揮重要作用。金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK及Φ11具有高度同源的N末端CHAP及酰胺酶結構域[27，28]，因此，將其CHAP作為主要催化基團，并加入特殊的細胞結合結構域（CBD）SH3b，將有望擴大其裂解功能[29]。李斯特菌噬菌體與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶裂解功能類似，也是通過催化切割N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺殘基將宿主細胞壁裂解，其裂解酶CBD不僅有種屬特異性，甚至有血清或菌株特異性[30]，因此，將其與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的酰胺酶活性進行結合，其多功能活性將會同時作用于2種病原菌。另外，還可以對全長裂解酶進行截斷處理，研究發(fā)現(xiàn)B族鏈球菌裂解酶PlyGBS的N端（GBS180）180氨基酸的殺菌活性比全長PlyGBS殺菌活性更好，但殺菌譜窄;而將其與廣譜裂解酶ClyR的CBD融合在C端表達后，得到新裂解酶ClyE，在提高殺菌活性的同時，又拓寬了殺菌譜。不僅如此，ClyR[31-34]也是一個經(jīng)嵌合改造的廣譜裂解酶，是將來自B族鏈球菌裂解酶PlyC的N端147個氨基酸與豬鏈球菌裂解酶PlySs2的C端85個氨基酸嵌合而成。裂解酶結構域重構可以作為多功能酶蛋白構建的新方法[35]，而把裂解酶蛋白進行有效配比亦能獲得復合裂解效果，也是獲得廣譜抗菌的新途徑。工程嵌合裂解酶可以通過重組不同來源的結構域或分子融合來構建，這樣嵌合體可能被賦予新的特性，包括結合特異性、殺菌譜、溶解性、穩(wěn)定性、活性等[36，37]。這些嵌合裂解酶也在醫(yī)療、農(nóng)牧業(yè)等多方面得到了應用。噬菌體裂解酶的單個或多個結構域也在診斷和免疫治療中得到廣泛應用[38，39]。此外，采用多肽等小分子進行聯(lián)合構建等方法使酶譜擴大[40]，同樣早期還有將酶與抗生素聯(lián)用等發(fā)揮協(xié)同抗菌等的研究[41]，這些不僅能放大酶的作用同時也會降低抗生素的用量，都將給裂解酶產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

4? 噬菌體裂解酶用于治療的發(fā)展趨勢

在抗生素逐漸對耐藥菌株失效的困境下，可以篩選耐藥菌的噬菌體，并將其產(chǎn)生的裂解酶單獨用藥或和抗生素等其他抗菌藥物一起聯(lián)合用藥[42]，這擴大了裂解酶的廣譜性，又避免了靶細胞的耐藥性;另外，也可以通過分子生物學的方法改造噬菌體裂解酶，擴大其宿主譜，使其能夠特異性裂解某一種屬的細菌，甚至不同種屬的細菌。從生物技術的角度來說，后一種方法更加切實有效， 因為研究者已經(jīng)通過分子生物學的方法，相對容易地改造優(yōu)化了裂解酶。其次，篩選、培育能在體內(nèi)長期循環(huán)的噬菌體也是一大趨勢。為延緩機體免疫系統(tǒng)對裂解酶的清除，延長裂解酶在體內(nèi)存留時間，可以通過連續(xù)傳代的方法來篩選那些發(fā)生變異后能在體內(nèi)長期循環(huán)的噬菌體，從而生產(chǎn)其對應的裂解酶。

盡管裂解酶有很多優(yōu)勢，但仍存在很多問題：①有研究指出天然裂解酶在大腸桿菌中表達時有些對表達菌株具有明顯的毒性，蛋白表達往往以包涵體的形式存在;②裂解酶本質是蛋白質，進入機體后易受到蛋白酶的攻擊，而具有較短的半衰期;③很難掌握裂解酶在治療過程中的最佳時間和最適劑量;④裂解酶治療的宿主譜很窄等。

關于噬菌體裂解酶對細菌的殺菌效果的研究日益增多，如何長期地保存裂解酶、如何高效安全地給藥、如何大量生產(chǎn)和應用裂解酶、如何評價裂解酶治療的效用等難題有待解決[43]。運用分子生物學領域的技術方法，從基因水平改造噬菌體，使其攜帶一種甚至多種細菌的通用配體，擴大其宿主譜，提高現(xiàn)有噬菌體裂解酶的裂解能力，以及更換表達菌株使裂解酶在真核生物和細胞水平上表達是今后的研究方向。

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