桂枝茯苓丸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠的治療作用及機(jī)制研究

陳盛鐿　朱少平　胡利　謝作鋼

【摘要】 目的探討桂枝茯苓丸對慢性非細(xì)菌性前列腺炎（ CNP）大鼠模型的治療作用，探討其可能機(jī)制。方法將15只雄性SD大鼠分為生理鹽水組、模型組和藥物治療組，每組各5只。適應(yīng)性飼養(yǎng)后，生理鹽水組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl生理鹽水注射。模型組及藥物治療組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl的5%甲醛溶液注射誘導(dǎo)前列腺炎癥，藥物治療組在誘發(fā)前列腺炎前2d開始以0.5 9/（kg·d）的桂枝茯苓丸懸液灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d后進(jìn)行膀胱測壓，測壓后采集大鼠的膀胱和前列腺組織，使用實(shí)時熒光定量PCR法檢測神經(jīng)生長因子（NCF）、三磷酸腺苷受體（ P2X2）、瞬時受體電位通道Al（ TRPAI）、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧酶2（ COX2）和雌激素受體（ER） mRNA的相對表達(dá)并進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果 與生理鹽水組大鼠相比，模型組大鼠排尿間隔較短、每周期無排尿性收縮次數(shù)較多、最大排尿壓較低、殘余尿量較少（P均> 0.05），藥物治療組大鼠上述指標(biāo)均較模型組改善（P均<0.05）。模型組大鼠的前列腺組織可見肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的基質(zhì)浸潤和不規(guī)則形狀的腺泡，藥物治療組大鼠的前列腺組織中未見上述改變。與生理鹽水組相比，模型組大鼠膀胱黏膜中NCF、P2X2和TRPAI以及前列腺腹葉中TNF-α、iNOS、COX2的mRNA相對表達(dá)均較高（P均<0.05）;而藥物治療組上述mRNA相對表達(dá)均低于模型組（P均<0.05）。模型組大鼠ER β mRNA相對表達(dá)、ERβ /ERα低于生理鹽水組，ERα mRNA相對表達(dá)高于生理鹽水組（P均<0.05）;而藥物治療組大鼠ERβmRNA相對表達(dá)、ERβ /ERα高于模型組，ERα mRNA相對表達(dá)低于模型組（P均<0.05）。大鼠上皮細(xì)胞核和前列腺腹葉細(xì)胞ERB染色在生理鹽水組中呈陽性，在模型組中染色減弱，在藥物治療組中亦呈陽性。結(jié)論桂枝茯苓丸可能通過激活ERβ，使前列腺的ERβ /ERα的表達(dá)比升高，改善前列腺炎癥及CNP刺激性膀胱過度活動。

【關(guān)鍵詞】 前列腺;炎癥;雌激素受體;桂枝茯苓丸

前列腺炎分為急性和慢性前列腺炎，慢性非細(xì)菌性前列腺炎（CNP）是前列腺炎中最常見的類型，占慢性前列腺炎的90%以上[1]。據(jù)報道，非細(xì)菌性前列腺炎與BPH和男性下尿路癥狀（IUTS）的發(fā)展有關(guān)[2]。研究顯示，前列腺活組織檢查（活檢）標(biāo)本中BPH體積和國際前列腺癥狀評分（IPSS）有關(guān)，且嚴(yán)重的炎癥與高IPSS相關(guān)[3-4]。前列腺炎癥可能是BPH和男性LUTS的重要病因之一。另有研究顯示，雌激素通過2種不同的雌激素受體（ ER）即ERα和ERβ調(diào)節(jié)組織炎癥[5]。ERβ的抗炎作用也在各種動物疾病模型中發(fā)揮作用，如腦脊髓炎、炎癥性腸病、膀胱炎和皮膚病。桂枝茯苓丸源于張仲景《金匱要略·婦人妊娠病脈并治》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍組成，原為針對妊娠期婦女化淤的方劑。近年研究顯示，其應(yīng)用己不限于婦科疾病，對治療CNP同樣有效[6]。因此，本研究利用前列腺內(nèi)注射甲醛誘導(dǎo)CNP大鼠模型來研究桂枝茯苓丸是否可以通過調(diào)節(jié)ERβ減輕膀胱過度活動，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠15只，8周齡，體質(zhì)量200 - 250g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[實(shí)驗(yàn)動物許可證SCXK（浙）2015-0001]，于恒定室溫下，12 h循環(huán)照明的環(huán)境中自適應(yīng)飼養(yǎng)7d，期間自由攝食與飲水。本研究所有的實(shí)驗(yàn)操作均符合中國實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定，研究方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理和倫理委員會批準(zhǔn)。

二、主要試劑及儀器

主要試劑包括：桂枝茯苓丸（成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司），DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），S-P免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）檢測試劑（北京中杉金橋公司）。主要儀器包括：Leica CM2500顯微成像系統(tǒng)，OlympusCX21顯微鏡，SHIMADZU電子分析天平（萬分一），萊卡石蠟切片機(jī)，勻漿器（江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠），旋渦混合器（北京北德科學(xué)器材有限公司），Hitachi-CR2082高速冷凍離心機(jī)，GZX-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

三、方法

1.分組

經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后將大鼠分生理鹽水組、模型組、藥物治療組，每組各5只。生理鹽水組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl生理鹽水注射。模型組及藥物治療組大鼠前列腺的雙側(cè)腹葉予50μl的5%甲醛溶液注射誘導(dǎo)前列腺炎癥[7]。藥物治療組大鼠從甲醛注射前2d開始，持續(xù)30 d予桂枝茯苓丸及生理鹽水制成的混懸液0.5 g/（kg.d）灌胃，模型組大鼠在相應(yīng)時間予等體積生理鹽水灌胃。

2.膀胱測壓

在大鼠前列腺內(nèi)注射50μl 50%甲醛溶液或生理鹽水28 d后行膀胱測壓。測定前2d用異氟烷麻醉大鼠，將PE-50聚乙烯導(dǎo)管從膀胱壁插入膀胱中，并且在膀胱測壓當(dāng)日將導(dǎo)管通過三通旋塞連接到壓力傳感器和注射泵上，以0.05 ml/min的速度將生理鹽水通過注射泵注入膀胱內(nèi)，并在Power-LabTM數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)上采集數(shù)據(jù)記錄膀胱內(nèi)壓。大鼠適應(yīng)環(huán)境至少2h后，分別記錄3次排尿周期以評估排尿間隔（ VI）、最大排尿壓（MVP）和無排尿性收縮次數(shù)（ NVC）。在3次排尿循環(huán)之后，停止注射生理鹽水并撤回膀胱內(nèi)導(dǎo)管，隨后通過腹壁手動壓縮膀胱測量排空后殘余尿量（ RV）。

3.組織病理學(xué)檢查

膀胱測壓后，用頸椎脫臼法處死大鼠，下腹部正中切口，直達(dá)腹腔，取前列腺腹葉和膀胱組織進(jìn)行組織學(xué)分析，用10%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木素一伊紅（HE）染色評估炎癥程度。前列腺的其余部分用于免疫組化。將石蠟切片脫蠟、梯度乙醇水化，在105℃下用高壓滅菌器以10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)抗原，冷卻后PBS沖洗，3%過氧化氫中孵育10 min消除過氧化物酶活性，蒸餾水和PBS沖洗。滴加10%正常山羊血清封閉30 min。滴加ERβ抗體在室溫下孵育1h。PBS洗滌，滴加HRP標(biāo)記的聚合物抗兔抗體溫育30 min。PBS洗滌，用DAB顯色液顯色2-5 min，蘇木素復(fù)染。

4.實(shí)時熒光定量PCR

處死大鼠后打開腹腔，取前列腺腹側(cè)葉和一部分膀胱黏膜組織至新的1.5 ml EP管中，用玻璃棒研磨，加入Trizol l ml充分振蕩混勻，加入氯仿0.2 ml，蓋緊后用力搖15 s，15 - 30℃孵育2 -3 min，4℃12 000×g離心15 min，取上清液，根據(jù)說明書使用Trizol試劑提取總RNA;使用ThermoScript RT-PCR系統(tǒng)將總RNA（l mg）合成為模板DNA。引物分別為ERβ（NM_012754）、ERa（NM_012689）、TNF-α（NM_012675）、 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS，XM_003750865）、環(huán)氧酶2（COX2，NM_017008）、三磷酸腺苷受體（P2X2，NM_207608）、瞬時受體電位通道A1（TRPAI，XM_008769306）、神經(jīng)生長因子（NGF，NM_001277055）和內(nèi)參基因GAPDH（ NM_017008）。其中引物ERB、ERα、TNF-α、COX2、NGF和GAPDH由QIAGEN（ QuantiTect Primers）預(yù)先設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，其他引物由Primer 3軟件設(shè)計(jì)（表1）。PCR反應(yīng)體系50μl，反應(yīng)條件為：94℃30 s、55℃30 s、72℃60 s，最后72℃延伸7 mm，共30個循環(huán)。SYBR Green法熒光定量PCR分析各基因的表達(dá)并利用2-△△ CT法分析相應(yīng)的數(shù)據(jù)，取每個靶基因與GAPDH的表達(dá)比值為相對表達(dá)的結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組大鼠的膀胱測壓結(jié)果比較

在前列腺內(nèi)注射50 μl 5%甲醛溶液或生理鹽水28 d后3組大鼠的排尿間隔（F=23.895，P< 0.001）、每排尿周期無排尿性收縮次數(shù)（F=38.224，P<0.001）、最大排尿壓（F=24.629，P< 0.001）、殘余尿量（F=10.236，P=0.002）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與生理鹽水組大鼠相比，模型組大鼠排尿間隔較短、每周期無排尿性收縮次數(shù)較多、最大排尿壓較低、殘余尿量較少（P均> 0.05），藥物治療組大鼠上述指標(biāo)均較模型組改善（P均< 0.05），見圖1。

二、3組大鼠的組織病理學(xué)比較

生理鹽水組大鼠前列腺組織的腹側(cè)葉中有規(guī)則形狀的腺泡和完整的基底膜（圖2A），模型組大鼠的前列腺組織可見肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的基質(zhì)浸潤和不規(guī)則形狀的腺泡（圖2B），然而，藥物治療組大鼠的前列腺組織中未見上述改變（圖2C）。3組大鼠的膀胱組織均無炎癥細(xì)胞積聚或上皮形成改變（圖2D-F）。

三、3組大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和IRPA1mRNA相對表達(dá)比較

生理鹽水組、模型組、藥物治療組大鼠膀胱黏膜中NGF（F=43.648，P<0.001）、P2X2（F= 37.017， P<0.001）和TRPAI （F= 34.572，P<0.001）的mRNA相對表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組大鼠膀胱黏膜中NCF、P2X2和TRPA1的mRNA相對表達(dá)均高于生理鹽水組（P均<0.05），藥物治療組大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和TRPAI的mRNA相對表達(dá)均低于模型組（P均<0.05），見圖3。

四、3組大鼠前列腺腹葉中TNF-α、iNOS、COX2、ERa、ERβ mRNA相對表達(dá)比較

3組大鼠前列腺腹葉中TNF-α（F=18.580，P<0.001）、iNOS（F=15.690，P<0.001）、COX2（F= 16.345，P=0.004）、ERa （F= 26.844，P<0.001）、ER3（F=20.657，P<0.001） mRNA相對表達(dá)和ERB /ERa（F=12.062，P=0.001）比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與生理鹽水組相比，模型組大鼠前列腺腹葉中TNF-α、iNOS、COX2、ERa、ERβ的mRNA相對表達(dá)均較高（P均<0.05），而藥物治療組的上述基因mRNA相對表達(dá)均低于模型組（P<0.05）。模型組大鼠ER[3 mRNA相對表達(dá)低于生理鹽水組，ERα mRNA相對表達(dá)高于生理鹽水組（P均< 0.05），而藥物治療組大鼠ER3 mRNA相對表達(dá)、ER3/ERa高于模型組，ERα mRNA相對表達(dá)低于模型組（P均<0.05），見圖4。

五、3組大鼠的免疫組化

在生理鹽水組大鼠中，ERβ在上皮細(xì)胞核和前列腺組織腹葉的細(xì)胞質(zhì)中觀察到陽性染色（圖5A）。在模型組大鼠中，不規(guī)則形狀腺泡的上皮細(xì)胞核中ERβ染色減弱，前列腺腹葉中可見炎性改變（圖5B）。在藥物治療組大鼠中ER3表達(dá)恢復(fù)到生理鹽水組大鼠的水平（圖SC）。

討論

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍組成，主藥桂枝辛甘而溫、溫通經(jīng)脈，以除淤滯，輔藥桃仁味苦甘平，活血化淤，丹皮、白芍味苦微寒，既能活血散淤，又可涼血以清淤熱，白芍兼能緩急止痛。茯苓甘淡性平，利水滲濕以祛痰，并能健脾益氣。該方寒溫并用，溫通祛淤而無耗傷陰血之弊，祛邪以固本，下淤不傷正。該藥原用于婦科，在子宮肌瘤和卵巢囊腫等有較好的治療效果，也有助女性調(diào)理月經(jīng)。近年多項(xiàng)研究顯示，其應(yīng)用己不限于婦科疾病，凡辨證屬于血淤濕滯者的各科疾病，均可加減用之且有效，這也是中醫(yī)學(xué)中“異病同治”的治法和優(yōu)勢。有研究報道，桂枝茯苓丸可降低血清雌激素受體（ ER）水平，但存在研究的樣本尚少，未能闡明治療機(jī)制[8]。

CNP患者常表現(xiàn)出膀胱刺激癥狀，如尿頻或尿急[9]。本研究中，與生理鹽水組相比，模型組大鼠排尿間隔較短、每周期無排尿性收縮次數(shù)較多、最大排尿壓較低、殘余尿量較少，表明CNP大鼠存在膀胱過度活動。NGF是膀胱過度活動癥（ OAB）的生物標(biāo)志物之一，其在患者的尿液中濃度很高[10]。本研究還檢測了P2X2和TRPAI受體的表達(dá)，這些主要在C纖維傳人途徑中表達(dá)的受體，已被認(rèn)為是OAB或膀胱炎癥中的病理生理機(jī)制[11]。因此，本研究中上述基因相對表達(dá)在膀胱中的上調(diào)可能導(dǎo)致CNP后膀胱活動增強(qiáng)[12]。

在模型組大鼠中，前列腺組織中ERα和炎癥相關(guān)基因如TNF-α、iNOS和COX2上調(diào)。然而，用桂枝茯苓丸治療可減少膀胱過度活動和下調(diào)ERα、TNF-α、iNOS和COX2的mRNA表達(dá)，并恢復(fù)ERβ的mRNA表達(dá)[13]。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，由巨噬細(xì)胞響應(yīng)組織損傷而產(chǎn)生，COX2和iNOS表達(dá)的上調(diào)誘導(dǎo)PGE2和NO的產(chǎn)生[14]。這些基因在組織炎癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

雖然已知雌激素參與調(diào)節(jié)前列腺生長，但也對前列腺上皮有不良影響，如異常增生、炎癥和癌變等[15]。研究顯示雌激素對前列腺的這些作用與ERα的激活有關(guān)[15-16]。本研究使用大鼠CNP模型研究ERα和ERβ表達(dá)的變化，通過注射甲醛誘導(dǎo)大鼠前列腺炎，可觀察到ERα的mRNA表達(dá)增加，而ERβ的表達(dá)下調(diào)。因此，甲醛誘導(dǎo)的前列腺炎可能會增加ERα與ERβ的相對表達(dá)水平，進(jìn)而可能導(dǎo)致慢性前列腺炎癥。一項(xiàng)BPH組織的研究也顯示，與正常前列腺組織相比，前列腺上皮細(xì)胞中ERα表達(dá)水平增加，表明ERα的激活是BPH相關(guān)增殖的重要機(jī)制[17]。

本研究未對前列腺炎癥表型進(jìn)行定量分析，包括前列腺炎或桂枝茯苓丸治療后異常腺泡的發(fā)生率，而主要關(guān)注膀胱表型，如膀胱過度活動和前列腺炎癥后膀胱的分子變化。因此，需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證ER介導(dǎo)的前列腺炎調(diào)節(jié)機(jī)制。

總之，炎癥相關(guān)基因表達(dá)的增加和ERβ/ERα的降低可能導(dǎo)致動物模型中CNP和膀胱過度活動的發(fā)生。而桂枝茯苓丸給藥治療可以升高ERβ/ERα，并抑制膀胱過度活動和前列腺炎癥。因此，ERβ刺激可能成為治療前列腺炎癥和BPH患者中刺激性膀胱癥的治療策略。

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