青霉素生產(chǎn)工藝優(yōu)化及代謝分析提高產(chǎn)量

李云龍 唐文俊 白成海 黃明志,2,* 儲(chǔ)炬,2 莊英萍,2

(1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2 過程系統(tǒng)工程教育部工程研究中心，上海 200237；3 呼倫貝爾北方藥業(yè)有限公司，牙克石 022150 )

自1929年弗萊明首次發(fā)現(xiàn)青霉素，距今已有近90年歷史，作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，青霉素仍然發(fā)揮著極其重要的作用。青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)也已經(jīng)進(jìn)行了60多年，通過菌種改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，現(xiàn)在青霉素產(chǎn)率較最初發(fā)現(xiàn)的原始菌株得到了極大提高[1]。其成本也有了大幅度降低，由最初的每10億單位數(shù)百美元到現(xiàn)在的不足10美元[2]。青霉素由一種昂貴的珍稀化工產(chǎn)品變?yōu)楝F(xiàn)在廉價(jià)的大宗化工產(chǎn)品[3]。

青霉素的工業(yè)生產(chǎn)方式采用多級(jí)補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝[4]，在發(fā)酵過程中流加補(bǔ)入葡萄糖、苯乙酸、硫酸銨等料液，同時(shí)通過帶放操作來控制發(fā)酵體積。通過控制流加培養(yǎng)液的速率，維持發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終處于極低濃度水平，既可以保證菌體生長，同時(shí)又不會(huì)對青霉素代謝形成阻遏作用[5]。青霉素的合成受溶解氧、溶解二氧化碳、pH、氨氮、碳源的調(diào)控，這些調(diào)控的產(chǎn)生不僅與攪拌、通氣、培養(yǎng)基組分有關(guān)，更受補(bǔ)料方式的影響[6]。有研究表明，菌體的形態(tài)與其所處的微觀及宏觀環(huán)境密切相關(guān)，環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和生理代謝發(fā)生全局性的改變[7-8]。

傳統(tǒng)青霉素發(fā)酵周期約為150h，至菌絲自溶前發(fā)酵單位基本達(dá)到最高時(shí)放罐產(chǎn)量得率最大[9]。通常在發(fā)酵至150h后菌體形態(tài)開始發(fā)生明顯變化，包括菌體對于糖的利用度、菌量合成以及發(fā)酵液流變特性都隨之發(fā)生變化，并且此階段青霉素合成速率快速降低。研究表明，把前中期的發(fā)酵液作為種子進(jìn)行再培養(yǎng)，即“倒種”，在充足的營養(yǎng)物質(zhì)條件下菌體能生成新的菌絲并大量合成青霉素[10-11]。所以在發(fā)酵后期遏制菌體自溶，改善菌絲形態(tài)，消除代謝物阻遏，盡可能維持高產(chǎn)物合成速率對提高整體發(fā)酵經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要。

本文分析青霉素傳統(tǒng)發(fā)酵工藝后期青霉素產(chǎn)率降低的可能原因，通過在補(bǔ)料分批發(fā)酵中后期進(jìn)行倒種操作和補(bǔ)加金屬鹽以及磷酸鹽溶液的操作，探討發(fā)酵液環(huán)境的改變對青霉素合成的影響，為青霉素發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供了新思路，對青霉素工業(yè)生產(chǎn)起到指導(dǎo)作用.

1 材料與方法

1.1 菌種

產(chǎn)黃青霉PL1819。

1.2 主要儀器及軟件

30L和50L高級(jí)生物反應(yīng)器(上海國強(qiáng))、LC-20A高效液相色譜儀(Agilent)、C18色譜柱(5μm, 250mm×4.6mm, Thermo)、DP-25顯微鏡(Olympus)、SHI-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(上海瑞茲)、Biostar在線監(jiān)控軟件(華東理工大學(xué))、MATLAB R2014b。

1.3 初始培養(yǎng)基組分及補(bǔ)料液組分

一級(jí)種子罐培養(yǎng)基：玉米漿140ml/L、蔗糖30g/L、(NH4)2SO43.6g/L、CaCO34.4g/L、玉米油1ml/L、消泡劑0.5ml/L。

二級(jí)種子罐、三級(jí)發(fā)酵初始培養(yǎng)基：檸檬酸·2H2O 1.6g/L、玉米漿10mL/L、FeSO4·7H2O 0.13g/L、CuSO4·5H2O 0.002g/L、MnSO40.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.02g/L、MgSO4·2H2O 2.5g/L、Na2SO43.5g/L、(NH4)2SO41.5g/L、KH2PO43.1g/L、玉米蛋白粉 1.6g/L、CaCO32.6g/L、玉米油 0.4mL/L、消泡劑0.04mL/L。

二、三級(jí)發(fā)酵過程補(bǔ)料料液成分：葡萄70%、苯乙酸35%、硫酸銨28%、氨水17%。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

米孢子在火焰保護(hù)下接種到30L一級(jí)發(fā)酵罐，發(fā)酵體積為20kg。一級(jí)種子罐不進(jìn)行pH調(diào)控，待pH由下降轉(zhuǎn)為升高時(shí)移入50L二級(jí)種子罐。二級(jí)種子罐發(fā)酵體積30L，開始增加過程補(bǔ)料。由于補(bǔ)入苯乙酸，二級(jí)種子罐中菌體已經(jīng)開始分化并合成青霉素。當(dāng)二級(jí)種子罐中青霉素效價(jià)達(dá)到10000U/mL時(shí)移入三級(jí)發(fā)酵罐，以保證接入三級(jí)發(fā)酵的高菌量和菌體分化特性。三級(jí)發(fā)酵體積為30L。整個(gè)發(fā)酵過程使用氨水控制pH在6.5，溫度25℃，罐壓0.08MPa。使用質(zhì)譜儀監(jiān)測發(fā)酵過程中尾碳、尾氧濃度，并通過biostar軟件在線監(jiān)測OUR、CER、RQ、pH、DO和溫度等。每8h取樣1次，檢測菌濃、青霉素濃度、PAA濃度。

倒種實(shí)驗(yàn)：倒種操作為放出一定質(zhì)量的發(fā)酵液并一次性補(bǔ)入等量的初始培養(yǎng)基。在發(fā)酵進(jìn)行到90h及150h分別進(jìn)行兩次倒種操作，倒種體積分別為15kg及7.5kg。所有倒種后的補(bǔ)糖控制依據(jù)均以生物量的實(shí)際稀釋倍數(shù)為準(zhǔn)，即若倒種后發(fā)酵液稀釋率為原液的70%，則當(dāng)前倒種后補(bǔ)糖速率為倒種前補(bǔ)糖速率的70%。

補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)：從發(fā)酵進(jìn)行到80h開始，通過流加方式連續(xù)補(bǔ)入磷酸鹽溶液，其配方為：KH2PO415g/L；(NH4)H2PO48.4g/L，補(bǔ)料速率為1g/min。120h至發(fā)酵結(jié)束，在補(bǔ)入的料液中加入包括磷酸鹽在內(nèi)的其他金屬鹽類，具體包括：檸檬酸·2H2O 15g/L、FeSO4·7H2O 3.5g/L、CuSO4·5H2O 1g/L、MnSO41g/L、ZnSO4·7H2O 1g/L、MgSO4·2H2O 13g/L。

1.5 菌濃測定

測細(xì)胞干重法確定菌液濃度[12]。每個(gè)取樣點(diǎn)重復(fù)測定3次，取平均值。

1.6 青霉素濃度、苯乙酸濃度測定

原始發(fā)酵液樣品離心取上清后按預(yù)估樣品濃度稀釋，使用高效液相色譜法[13]檢測樣品中青霉素G、苯乙酸濃度。

1.7 代謝流計(jì)算

產(chǎn)黃青霉代謝網(wǎng)絡(luò)以及發(fā)酵中期和后期菌體組分參照J(rèn)orgensen等[14]的研究，菌體組分見表1。MATLAB R2014b作為代謝流分析中的數(shù)學(xué)計(jì)算工具。根據(jù)代謝平衡原理，列出胞內(nèi)代謝物對應(yīng)的反應(yīng)方程式，其中，氧氣對應(yīng)的方程式用來驗(yàn)證計(jì)算結(jié)果，提取等號(hào)左邊系數(shù)作為矩陣A，未知數(shù)作為矩陣X，等號(hào)右邊記作b，則X=A/b或X=inv(A)×b。發(fā)酵過程中測量葡萄糖消耗速率(qs)、青霉素G比合成速率(qPenG)、氧氣比消耗速率(qO2)、二氧化碳比生成速率(qCO2)以及菌體比生長速率(u)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵傳統(tǒng)工藝

在傳統(tǒng)的產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝中，經(jīng)過二級(jí)發(fā)酵，終末青霉素濃度達(dá)到10000U/mL，此時(shí)總發(fā)酵周期約為110h(其中一級(jí)發(fā)酵70h，二級(jí)發(fā)酵40h)。在三級(jí)發(fā)酵初期流加補(bǔ)入葡萄糖、苯乙酸、氨水及硫酸銨溶液，發(fā)酵44h后發(fā)酵質(zhì)量達(dá)到35kg，并在隨后開始以8h為周期的帶放操作，通過帶放操作維持發(fā)酵體積在34～35kg之間。發(fā)酵過程中菌體干重及青霉素濃度變化如圖1所示，可見發(fā)酵至中期，即發(fā)酵100h以后，青霉素濃度增長速率變緩，在164h達(dá)到峰值，隨后開始快速下降。此時(shí)成青霉素的合成速率已經(jīng)低于其在發(fā)酵液中分解的速率，至188h放罐時(shí)較最高值下降了約16%。從發(fā)酵中期開始菌體濃度趨于穩(wěn)定，發(fā)酵后期有輕微下降。

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中不同發(fā)酵階段對應(yīng)的一些代謝參數(shù)列于表2，可看出在發(fā)酵180h青霉素比合成速率(qPenG)已經(jīng)降為負(fù)值，且菌體對葡萄糖得率(YX/Glc)、產(chǎn)物對葡萄糖得率(YPenG/Glc)以及產(chǎn)物對苯乙酸得率(YPenG/PAA)均出現(xiàn)不同程度的下降。結(jié)合菌濃及青霉素濃度的變化情況，可知在發(fā)酵后期菌體的生長及代謝均受到了嚴(yán)重的影響。發(fā)酵后期青霉素濃度的降低一方面是受到菌體自溶，菌濃降低導(dǎo)致，另一方面則與菌體合成青霉素能力下降有關(guān)，底物葡萄糖可能更多地用于與青霉素合成無關(guān)的代謝途徑中。

Douma等[15]研究表明，在稀釋率為0.05/h的恒化培養(yǎng)中，青霉素比合成速率在前100h快速增長并達(dá)到最大值，隨后開始緩慢降低，即經(jīng)過5代繁殖生長后，青霉素的合成速率開始下降。其原因可能是菌體出現(xiàn)了不可逆的衰亡或退化。而補(bǔ)料分批發(fā)酵中，稀釋率在中后期維持在0.01/h左右，則理論上產(chǎn)黃青霉能在5個(gè)代時(shí)(500h)內(nèi)，維持較高的青霉素合成能力。而在實(shí)際的發(fā)酵過程中僅100h左右其產(chǎn)物合成速率就出現(xiàn)了快速的降低，這與相關(guān)研究結(jié)果存在明顯差距。故考慮導(dǎo)致菌體青霉素合成能力下降的原因可能是后期發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的不足和有毒代謝物的過度積累。

表1 發(fā)酵148h細(xì)胞組分Tab.1 Composition of biomass in 148h

圖1 補(bǔ)料分批發(fā)酵菌濃與青霉素G濃度變化Fig.1 Changes of biomass and normalized penicillin G in batch fermentation

表2 不同發(fā)酵階段比青霉素合成速率及得率對比Tab.2 The specific rates and yields at different fermentation stages

2.2 后期倒種和后期補(bǔ)鹽工藝

2.2.1 后期倒種和后期補(bǔ)鹽工藝對青霉素合成的影響

在倒種工藝中，發(fā)酵至90h進(jìn)行第一次倒種操作，即放出約50%發(fā)酵體積(15kg)的發(fā)酵液，并同時(shí)補(bǔ)入等量的新鮮培養(yǎng)基。發(fā)酵150h進(jìn)行第二次倒種，倒種量為約25%發(fā)酵體積(7.5kg)。倒種操作盡管大量減少和降低了罐內(nèi)的總菌體量以及青霉素濃度，但同時(shí)也稀釋了胞外有毒物質(zhì)的積累。加之新鮮培養(yǎng)基的補(bǔ)入，使得菌體能夠維持正常生長以及較高青霉素合成速率。在額外補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵至80～120h，流加補(bǔ)入磷酸鹽溶液，120h之后增加金屬鹽溶液的補(bǔ)入。

如圖2所示，倒種和發(fā)酵后期補(bǔ)鹽工藝較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵周期都得到了顯著延長。發(fā)酵后期補(bǔ)鹽工藝中在200h左右效價(jià)才開始降低，且降低趨勢緩慢，整個(gè)有效發(fā)酵周期比傳統(tǒng)工藝延長了50h以上。而在倒種工藝中，在264h放罐時(shí)，產(chǎn)物濃度依舊能夠保持快速增長的趨勢。圖3為單批次青霉素累計(jì)總產(chǎn)量，可以看出在170h后，傳統(tǒng)工藝青霉素總量開始下降，而倒種和后期補(bǔ)鹽工藝在170h處仍在繼續(xù)增加，并在之后很長時(shí)間內(nèi)保持這一趨勢。至188h，傳統(tǒng)工藝發(fā)酵終止，此時(shí)倒種工藝和后期補(bǔ)鹽工藝中青霉素總量較傳統(tǒng)工藝分別高出17.46%和28.46%。圖4表示3種工藝整個(gè)發(fā)酵過程中qPenG的變化情況。3種工藝中qPenG均在50～100h之間達(dá)到最大值，隨后傳統(tǒng)工藝和后期補(bǔ)鹽工藝的qPenG開始下降，但后期補(bǔ)鹽工藝的下降速率更加緩慢，且直至發(fā)酵結(jié)束始終高于傳統(tǒng)工藝，說明發(fā)酵后期補(bǔ)入的鹽溶液對維持青霉素繼續(xù)合成起到了顯著效果。而倒種工藝整個(gè)發(fā)酵過程中qPenG均高于其他兩組工藝，且并未出現(xiàn)明顯下降，可見倒種操作使發(fā)酵液質(zhì)量得到了巨大的改善，不僅通過補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基稀釋發(fā)酵液給菌體提供了更好的生長代謝環(huán)境，也利用帶放操作去除了培養(yǎng)液中可能積累的有害物質(zhì)，使其能夠長時(shí)間維持較強(qiáng)的青霉素合成能力。

圖2 不同調(diào)控策略下青霉素濃度比較Fig.2 The normalized penicillin G contents comparison under different control strategies

圖3 不同調(diào)控策略下總青霉素產(chǎn)量的比較Fig.3 Comparison of total produced penicillin amount under different control strategies

圖4 不同調(diào)控策略下青霉素比合成速率的比較Fig.4 Comparison of specific penicillin production rates under different control strategies

2.2.2 后期倒種和后期補(bǔ)鹽工藝對產(chǎn)黃青霉菌絲形態(tài)的影響

青霉素的合成與菌絲形態(tài)之間存在密切關(guān)系，菌絲分化形成孢子階段也是產(chǎn)物快速合成時(shí)期。要使細(xì)胞分化和生長朝著有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累方向發(fā)展，必須要有足夠數(shù)量的菌絲體并能長期維持下去，才能使次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。發(fā)酵后期隨著發(fā)酵環(huán)境的惡化，菌絲體逐漸形成膨大的短桿狀或球狀的異化菌絲，這種異化菌絲的青霉素合成能力下降，對發(fā)酵有不利影響[16-18]。如圖5a、c、e分別為發(fā)酵24h 3組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)，b、d、f分別為發(fā)酵152h 3組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)?？梢姲l(fā)酵前期菌體均呈細(xì)長絲狀，各組之間無明顯差異；發(fā)酵至152h，傳統(tǒng)工藝菌體異化現(xiàn)象嚴(yán)重，而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組則具有較好的菌絲形態(tài)。

圖5 不同調(diào)控策略在不同發(fā)酵周期菌絲形態(tài)的比較Fig.5 Comparison of mycelial morphology under different control strategies in different fermentation stages

2.2.3 后期倒種和后期補(bǔ)鹽工藝對菌體及產(chǎn)物得率的影響

對發(fā)酵過程中菌體和產(chǎn)物得率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖6。圖6A中，3組工藝在發(fā)酵前期菌體對糖得率均迅速下降，100h后開始趨于穩(wěn)定，說明后期菌體生長變慢，細(xì)胞代謝活動(dòng)開始逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐院铣僧a(chǎn)物為主。150h開始，實(shí)驗(yàn)組菌體對糖得率稍稍高于傳統(tǒng)工藝組，驗(yàn)證了倒種和后期補(bǔ)鹽操作對菌體生長起到了積極作用。從產(chǎn)物對糖率(圖6B)和產(chǎn)物對苯乙酸得率(圖6C)可以明顯看出，發(fā)酵前期3組實(shí)驗(yàn)的得率基本相同，均呈增長趨勢，并在100h左右達(dá)到最大值。隨后，傳統(tǒng)工藝得率降低，后期補(bǔ)鹽工藝雖然也開始下降，但其下降速率遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)工藝。發(fā)酵188h，傳統(tǒng)工藝發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)倒種工藝和額外補(bǔ)鹽工藝中產(chǎn)物對糖得率分別提高40.02%和34.55%。倒種工藝在整個(gè)發(fā)酵過程中均能保持產(chǎn)物對糖得率在較高值，發(fā)酵250h之后仍未降低，且產(chǎn)物對苯乙酸得率基本維持在100%左右。說明發(fā)酵中后期兩次倒種操作給產(chǎn)黃青霉的合成代謝提供了更好的環(huán)境，提高了菌體對底物及前體的利用率，確保底物及前體最大限度的參與到青霉素合成相關(guān)的次級(jí)代謝中。兩批實(shí)驗(yàn)組的對比發(fā)現(xiàn)，倒種工藝較后期補(bǔ)鹽工藝對抑制發(fā)酵后期菌體老化，促進(jìn)產(chǎn)物合成有更優(yōu)秀的效果。本研究認(rèn)為這是由于倒種操作不僅一次性補(bǔ)入菌體生長需要的其他營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還放掉大量的原發(fā)酵液，降低了發(fā)酵液內(nèi)有毒代謝物的濃度。而倒種后仍進(jìn)行正常的帶放操作，則保證了在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)，發(fā)酵液都能給菌體提供良好的代謝環(huán)境，維持青霉素合成能力在較高水平。

圖6 傳統(tǒng)工藝組和實(shí)驗(yàn)組得率對比Fig.6 Comparison of yield between experimental group and control group

2.3 不同工藝操作下產(chǎn)黃青霉代謝流分析

青霉素的產(chǎn)率與初級(jí)代謝具有密切關(guān)系，初級(jí)代謝對青霉素合成的限制主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：3個(gè)氨基酸前體(α-氨基己二酸，纈氨酸和半胱氨酸)的合成、NADPH和ATP的供應(yīng)[19]。為了探究發(fā)酵中后期額外補(bǔ)鹽對青霉素合成代謝的影響，對發(fā)酵后期傳統(tǒng)工藝及額外補(bǔ)鹽工藝進(jìn)行了代謝流分析。發(fā)酵148h，額外補(bǔ)鹽工藝與傳統(tǒng)補(bǔ)料工藝中一些物質(zhì)比轉(zhuǎn)化率如表3所示。發(fā)酵148h，額外補(bǔ)鹽工藝中底物葡萄糖比消耗速率、氧氣比消耗速率以及二氧化碳比生成速率較傳統(tǒng)工藝分別降低了9.75%、21.7%和15.5%。同時(shí)，菌體比生長速率、苯乙酸比消耗速率以及青霉素G比合成速率則分別提高了25.35%、43.8%和15.2%。這說明額外補(bǔ)鹽工藝降低了菌體對底物的消耗，提高了底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，這對工業(yè)發(fā)酵是十分有利的。

表3 148h傳統(tǒng)工藝與額外補(bǔ)鹽工藝發(fā)酵參數(shù)的比較Tab.3 Comparison of fermentative parameters between control and additional feeding groups in 148h

兩種不同補(bǔ)料工藝在發(fā)酵148h的代謝流分析如圖7所示，傳統(tǒng)工藝和額外補(bǔ)鹽工藝中氧消耗速率計(jì)算值分別為1.46和1.07mmol/(gDW·h)，與所測值相符合。額外補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)中，6-磷酸葡萄糖到5-磷酸核酮糖的反應(yīng)速率提高了27.5%。磷酸戊糖途徑能產(chǎn)生半胱氨酸合成所需的NADPH，對青霉素的生產(chǎn)至關(guān)重要。纈氨酸以及半胱氨酸合成途徑的反應(yīng)速率分別較原始工藝提高了19.4%和15.1%。而TCA循環(huán)中草酰乙酸到檸檬酸途徑反應(yīng)速率降低了20.9%。這說明額外補(bǔ)鹽操作明顯影響了青霉素合成代謝節(jié)點(diǎn)的反應(yīng)速率，磷酸戊糖途徑以及氨基酸前體合成反應(yīng)速率得到提高，無效的TCA循環(huán)減少，底物更多的參與到青霉素代謝途徑中，從而提高了青霉素產(chǎn)率。同時(shí)也表明對于該菌種，影響其青霉素合成的主要代謝節(jié)點(diǎn)是NADPH和氨基酸前提的供應(yīng)。

初級(jí)代謝中氨基酸和輔助因子的大量合成有利于提高青霉素的產(chǎn)量。所以保證活躍的中心碳代謝對青霉素發(fā)酵具有重要作用。青霉素合成途徑中異青霉素合成酶需要Fe2+作為輔基，Mn2+和Cu2+通常也是某些酶的輔基，這些金屬離子的加入對青霉素合成具有促進(jìn)作用[20]。倒種實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵后期補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)為青霉素初級(jí)代謝提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠維持發(fā)酵后期菌體的正常生長，使得青霉素的合成速率保持較高水平。

在青霉素的發(fā)酵過程中，一些代謝物的積累也會(huì)對青霉素合成造成不利影響。高濃度的賴氨酸對其合成途徑的高檸檬酸合酶具有反饋抑制作用，最終影響α-氨基己二酸的合成，同時(shí)對三肽合成酶具有直接的抑制作用。另一方面，谷氨酸與甘氨酸能夠在相關(guān)酶催化下合成谷胱甘肽。谷胱甘肽作為一種ACV類似物，能抑制異青霉素N合成酶(IPNS)的活性[21]。前期研究表明IPNS是青霉素合成的主要限速酶之一[22]，因此谷胱甘肽在胞內(nèi)/胞外的逐漸積累會(huì)抑制青霉素合成途徑的酶活性，從而降低其合成速率。倒種實(shí)驗(yàn)通過放掉大量的發(fā)酵液同時(shí)補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)基，對發(fā)酵液內(nèi)的有毒代謝物起到了稀釋作用，解除了高濃度的有毒代謝物對青霉素合成的抑制作用。發(fā)酵后期補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)由于額外增加了補(bǔ)料量，使得發(fā)酵后期的稀釋率得到提高，一定程度上緩解了有毒代謝物的積累，使得青霉素的合成速率得以維持。

3 結(jié)論

在產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝中，存在青霉素合成速率過早下降的問題。本文通過在發(fā)酵中后期進(jìn)行兩次倒種操作有效地緩解了這一現(xiàn)象的發(fā)生，使青霉素合成速率始終維持在較高水平，發(fā)酵周期較傳統(tǒng)工藝延長了近1倍，總產(chǎn)量提高了17.46%。根據(jù)倒種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝后期，青霉素合成速率降低的主因并不是菌體的自衰亡或退化，而是由于發(fā)酵液內(nèi)供青霉菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)不足和某些有毒代謝物質(zhì)的過量積累。

倒種操作雖然效果明顯，但該操作導(dǎo)致發(fā)酵中后期大量仍具有較高產(chǎn)物合成能力的菌體流失，并且隨后需補(bǔ)入額外的營養(yǎng)物質(zhì)來彌補(bǔ)損失的菌體，這在工業(yè)規(guī)模上效益不高，不具有應(yīng)用性。發(fā)酵后期額外補(bǔ)加磷酸鹽及其他金屬離子明顯改善了發(fā)酵液環(huán)境，遏制了菌體異化，促進(jìn)了前體氨基酸和NADPH的合成，能在一定程度上緩解青霉素合成速率的下降，發(fā)酵周期延長了50h以上，青霉素總產(chǎn)量提高了28.46%。所以工業(yè)生產(chǎn)上解決這一問題的關(guān)鍵還在于過程補(bǔ)料及中后期比生長速率的控制。

圖7 發(fā)酵148h傳統(tǒng)工藝與額外補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)工藝代謝流比較Fig.7 Comparison of metabolic fluxes between control and additional feeding group in 148h