肉芽腫性乳腺炎的病原菌分布及藥敏分析

唐玲玲 劉成義 紀(jì)存委 刁福強(qiáng) 賴衛(wèi)明 穆小萍

(廣東省婦幼保健院，廣州 511400)

乳腺炎作為女性常見病，按病因不同可分為急性化膿性乳腺炎、肉芽腫性乳腺炎、漿細(xì)胞性乳腺炎等。其中急性化膿性乳腺炎和肉芽腫性乳腺炎與細(xì)菌感染關(guān)系較為密切。女性乳腺結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種腺體及內(nèi)容物，故而不同類型乳腺炎的病原菌分布具有多樣性。肉芽腫性乳腺炎是一類多在非哺乳期以肉芽腫為主要病理特征乳腺慢性炎癥，以小葉性多見，可繼發(fā)潰瘍、竇道，易復(fù)發(fā)且難愈合，確診主要依賴病理活檢。肉芽腫性乳腺炎較少見，但近年發(fā)病率有增加趨勢[1]。近年有研究表明肉芽腫性乳腺炎與棒狀桿菌感染關(guān)系密切，以Taylor等[2]的研究證據(jù)最為充分，但文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量較少且細(xì)菌分布結(jié)果有較大差異。有些實(shí)驗(yàn)室對棒狀桿菌采用紙片擴(kuò)散法(KB法)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，而美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)執(zhí)行的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)并無棒狀桿菌紙片擴(kuò)散法藥敏標(biāo)準(zhǔn)[3]，并且適合臨床應(yīng)用的最低抑菌濃度(MIC)藥敏方法較少，給臨床抗生素治療造成影響。本研究旨在分析肉芽腫性乳腺炎的細(xì)菌分布及藥物敏感性結(jié)果，為疾病機(jī)制探討及臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本收集于2016年1月—2017年12月我院乳腺防治中心收治根據(jù)病理結(jié)果確診的肉芽腫性乳腺炎患者共436例，以進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗(yàn)。收集棒狀桿菌共30株，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)。用無菌方式采集乳腺膿液，標(biāo)本的采集和培養(yǎng)嚴(yán)格按《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》的相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

Lecia DM1000光學(xué)顯微鏡，HF90/HF240二氧化碳培養(yǎng)箱，荷蘭Anoxomat MARKⅡ全自動厭氧/微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)，ESCO AB2-6S1外排式生物安全柜。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(廣州迪景)，巧克力血瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖)，念珠菌顯色平板(廣州迪景)，陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯(上海瑞楚)，革蘭快速染色液(珠海貝索)。VITEK 2全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(Biomerieux)、與其配套的GP、GN鑒定卡，RapID?CB PLUS棒狀桿菌鑒定板條，一次性微量聚乙烯96孔培養(yǎng)板(Jet Biofil)，青霉素、萬古霉素、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、克林霉素、利奈唑胺、利福平標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)。

1.3 方法

1.3.1 接種與培養(yǎng)

將合格的膿液標(biāo)本采用平板劃線法分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板，真菌接種于真菌顯色平板，厭氧或微需氧菌培養(yǎng)使用厭氧/微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)。需氧菌接種后在35℃恒溫的5% CO2培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1～2d，若為菌落細(xì)小、生長緩慢的革蘭陽性細(xì)菌則適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至5d防止漏檢。

1.3.2 病原菌鑒定

培養(yǎng)陽性標(biāo)本先進(jìn)行涂片制備及革蘭染色，根據(jù)鏡下形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。常規(guī)細(xì)菌使用VITEK 2全自動微生物鑒定儀及配套GP、GN卡進(jìn)行鑒定；棒狀桿菌使用RapID?CB PLUS鑒定板條進(jìn)行鑒定；真菌按照其顯色平板的不同顏色進(jìn)行鑒定。

1.3.3 棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)

棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判讀均根據(jù)CLSI M45-A3標(biāo)準(zhǔn)采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行。參照CLSI M45-A3標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合臨床常用藥物選擇青霉素、萬古霉素、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、克林霉素、利奈唑胺、利福平共8種藥物做藥敏試驗(yàn)。先對抗菌藥物粉末進(jìn)行溶解、稀釋，連續(xù)倍比稀釋成256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/mL共12個濃度。將培養(yǎng)好的棒狀桿菌與瓊脂混合成1.5×108CFU/mL，待轉(zhuǎn)移至微量聚乙烯96孔板。在微量聚乙烯96孔板中加入不同濃度抗生素與稀釋好的瓊脂菌液，同時設(shè)陰性對照和空白對照。在35℃空氣環(huán)境下培養(yǎng)24h后記錄結(jié)果，培養(yǎng)過程中使用帶蓋濕盒防止液體揮發(fā)，培養(yǎng)箱定期滅菌以防止受霉菌污染。

1.3.4 藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量控制

每批棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)均設(shè)質(zhì)控，質(zhì)控菌株藥敏結(jié)果在允許范圍內(nèi)判為本次試驗(yàn)有效。根據(jù)CLSI M45-A3標(biāo)準(zhǔn)，青霉素、萬古霉素、亞胺培南、美羅培南、克林霉素、利奈唑胺、利福平用肺炎鏈球菌ATCC49619作為質(zhì)控菌株，慶大霉素用大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果

2.1 我院肉芽腫性乳腺炎就診率統(tǒng)計(jì)

2016年1月—2017年12月于本院乳腺病防治中心就診的肉芽腫性乳腺炎共505例，占就診乳腺炎患者的3.88%(505/13011)。年齡19～49歲，其中21～30歲分布最多，占360例。

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特點(diǎn)

培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)分離后，觀察菌落形態(tài)特點(diǎn)并取純菌落進(jìn)行鏡下形態(tài)觀察(圖1～2)。慢性肉芽腫性乳腺炎則以細(xì)小、光滑、凸起的灰白圓形菌落較多，其鏡下形態(tài)為革蘭染色陽性直或微彎曲桿菌，縱邊不平行，常有異染顆粒和末端膨大，常成對并排、V形、簇狀排列。觀察菌落與鏡下形態(tài)特點(diǎn)可進(jìn)行大致分類，繼而選擇VITEK鑒定卡、RapID?CB PLUS鑒定板條或其他生化鑒定試驗(yàn)等方法鑒定到種。

2.2.2 肉芽腫性乳腺炎病原菌分布

在436例肉芽腫性乳腺炎患者送檢標(biāo)本中，有111例細(xì)菌培養(yǎng)陽性，總培養(yǎng)陽性率為25.45%。111例培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)鑒定以棒桿菌屬為主，棒狀桿菌陽性率為70.27%(表1)。

2.2.3 肉芽腫性乳腺炎中分離的棒狀桿菌類型分布(板條鑒定法)

肉芽腫性乳腺炎中分離的78株棒狀桿菌屬經(jīng)RapID? CB PLUS板條鑒定，以微小棒狀桿菌和G群棒狀桿菌為主，棒狀桿菌屬中構(gòu)成比為61.5%，總陽性標(biāo)本中構(gòu)成比為43.23%(表2)。

圖1 棒狀桿菌菌落形態(tài)(血平板)Fig.1 Morphology of Corynebacterium

圖2 棒狀桿菌鏡下形態(tài)(革蘭染色，×1000)Fig.2 Microscope morphology of Corynebacterium (Gram, ×1000)

表1 肉芽腫性乳腺炎病原菌分布Tab.1 Distribution of pathogenic bacteria in granulomatous mastitis

表2 肉芽腫性乳腺炎中分離的棒狀桿菌類型分布(板條鑒定法)Tab.2 Distribution of corynebacterium types isolated from granulomatous mastitis (CB PLUS)

2.3 棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

收集肉芽腫性乳腺炎患者中分離的棒狀桿菌共30株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

3 討論

肉芽腫性乳腺炎是非哺乳期乳腺炎的一種，近年來發(fā)病率有上升的趨勢，其不斷增高的發(fā)病率威脅著女性健康[4]。其發(fā)生機(jī)制目前仍存在著較大爭議。Fletcher等[5]的研究認(rèn)為自身免疫性因素在該疾病中起著重要因素。而近年來很多學(xué)者開始對棒狀桿菌和肉芽腫性乳腺炎的關(guān)系進(jìn)行關(guān)注。Fernández等[6]的研究報(bào)道了克氏棒桿菌為肉芽腫性乳腺炎的重要病原菌。因病因不明確，臨床的治療和處理方法也存在爭議，主要有類固醇激素治療、免疫抑制劑治療、手術(shù)以及抗生素使用[7]。也有研究顯示噬菌體療法也可用于乳腺炎的治療[8]。若一般抗生素治療無效，需換成治療周期長達(dá)半年的抗分枝桿菌三聯(lián)藥物[9]，所以選擇合適的抗生素治療非常重要。本院就診于乳腺病防治中心的肉芽腫性乳腺炎患者占乳腺炎的3.88%。雖然發(fā)病率不高，但是這部分患者多反復(fù)就診，容易給患者身心健康造成嚴(yán)重影響。

表3 30株棒狀桿菌分布及藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Distribution of 30 corynebacterium and drug susceptibility test results

本研究中436例肉芽腫性乳腺炎患者標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)陽性者111例，而棒狀桿菌陽性率是70.27%(78/111)，另外其他革蘭陽性菌有7例，這部分細(xì)菌使用板條鑒定法未鑒定出，但是也不排除棒狀桿菌的可能，表明棒狀桿菌感染與肉芽腫性乳腺炎具有密切關(guān)系。本研究中肉芽腫性乳腺炎棒狀桿菌分布主要以微小棒狀桿菌和G群棒狀桿菌為主，構(gòu)成比為61.5%(48/78)。棒狀桿菌陽性率、棒狀桿菌類型分布與相關(guān)文獻(xiàn)存在差別。Taylor等[2]的研究中，棒狀桿菌陽性率為45.00%，分離的棒狀桿菌以谷氨酸棒狀桿菌為主。本研究中棒狀桿菌陽性率為70.27%，高于Taylor等[2]的研究，且棒狀桿菌類型分布不同?？赡艿脑?yàn)榈貐^(qū)差異和方法學(xué)限制。在同屬廣東地區(qū)的劉曉雁等[10]的研究中，棒狀桿菌陽性率74.20%，以水生棒狀桿菌和微小棒狀桿菌為主，構(gòu)成比分別為26.20%和21.30%，與本研究結(jié)果相對接近，說明可能存在地區(qū)差異。本研究中棒狀桿菌鑒定采用板條鑒定法，原理是過氧化物酶、黃色素與鑒定板條上18種化學(xué)反應(yīng)一起構(gòu)成7組鑒定試驗(yàn)，得到7位編碼數(shù)字鑒定到種。棒桿菌屬各菌種間化學(xué)反應(yīng)可能差別較小，且存在一些弱陽性結(jié)果影響判斷，故方法學(xué)上差異可能也是導(dǎo)致菌株分布存在差異的原因之一。增強(qiáng)鑒定可靠性可使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)或測定16S rDNA基因核酸序列在GenBank/NCBI基因庫進(jìn)行 BLAST同源比對鑒定。本研究下一步將會通過飛行時間質(zhì)譜的方法對棒狀桿菌進(jìn)行鑒定研究。

本研究對30例棒狀桿菌采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌對萬古霉素、利奈唑胺、慶大霉素和利福平敏感性較高(＞90%)，對青霉素、亞胺培南、美羅培南、克林霉素敏感率均低于55%，與文獻(xiàn)[11]相似，另外，文獻(xiàn)指出棒狀桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素較耐藥，并可出現(xiàn)多重耐藥情況。由于CLSI中沒有棒狀桿菌KB法的藥敏標(biāo)準(zhǔn)，而本研究采用的是微量肉湯稀釋法測定細(xì)菌的最小抑菌濃度，因此可以為臨床治療棒狀桿菌提供可靠依據(jù)。

綜上所述，棒狀桿菌感染與肉芽腫性乳腺炎有著密切關(guān)系，細(xì)菌感染可能是肉芽腫性乳腺炎發(fā)病、疾病進(jìn)展的原因之一，治療時感染的控制和藥敏結(jié)果應(yīng)用不可忽略，伴有棒狀桿菌感染的肉芽腫性乳腺炎可用萬古霉素、利奈唑胺、慶大霉素和利福平等敏感性較高的藥物進(jìn)行治療。