中藥仙鶴草不同藥用部位的體外藥效學(xué)研究＊

田露露，包永睿，王 帥，李天嬌，劉金瑛，孟憲生

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室 大連 116600；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029）

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，味苦、澀，性平，歸肺、肝、脾經(jīng)，有軟堅散結(jié)、收斂止血、益氣扶正的功效[1-3]。其藥用部位演變過程為“根、根芽、全草、地上部分”，《別錄》曰：“八月采根，曝干?！薄侗静輬D經(jīng)》亦曰：“三月、八月采根，日干?！闭f明其用藥部位是根，而《蜀本草·圖經(jīng)》則明確指出：“二月、三月采牙，日干”，說明仙鶴草的藥用部位已從根而逐步精確到了根芽。到晉、唐時期，龍牙草的藥用部位已從根芽擴(kuò)大到全草，如《范汪方》用狼牙草莖葉熟搗，敷貼之，治金瘡，兼能止血，古人充分認(rèn)識到了仙鶴草各個部位的作用，擇而用之，2015版藥典載仙鶴草藥用部位為干燥地上部分[1,4]。近年來，雖然關(guān)于仙鶴草抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等活性的研究得到重視，但其不同部位的精準(zhǔn)應(yīng)用實驗研究報道較少[5]。故本實驗建立仙鶴草不同藥用部位的指紋圖譜并進(jìn)行相似度評價，同時比較研究仙鶴草不同藥用部位抗腫瘤、抗氧化、抗凝血作用，以期為仙鶴草藥材不同藥用部位的合理使用提供科學(xué)依據(jù)，為生藥不同部位的精準(zhǔn)應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞株HGC-27細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞均由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供；昆明種小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司（合格證號：SYXK（遼）2013-0009）；仙鶴草藥材（采自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)百草園）遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為Agrimoniapilosa Ledeb.的干燥全草；2，2'-聯(lián)氮-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；小鼠凝血酶原（PT）酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清、胰酶、MTT購自美國Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100型快速高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SpectraMaxPlus384光吸收酶標(biāo)儀（美國MolecularDrvices公司）。

1.3 供試品溶液的制備及藥液的配制

分別取仙鶴草根、莖、葉、花粉末（過3號篩）約5.0 g，置于圓底燒瓶中，加入75 mL50%的乙醇溶液，加熱回流提取1 h，濾過，回收溶劑至干，供體外抗腫瘤、抗氧化、促凝血作用實驗用，根、莖、葉、花的得率分別為11.0%、13.8%、27.6%、24.8%；同法制得仙鶴草根、莖、葉、花提取液，濾過，取續(xù)濾液搖勻過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC分析實驗用。

1.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

取2.1項供試品溶液，AgilentTC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.3%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），程序梯度洗脫0-35 min，5%-18%B；35-40 min，18%-18%B；40-55 min，18%-26%B；55-75 min，26%-40%B；75-80 min，40%-100%B，流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長320 nm。分析檢測，得到仙鶴草藥材不同藥用部位的指紋圖譜。應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》（國家藥典委員會）軟件，將實驗結(jié)果導(dǎo)入軟件生成對照圖譜，進(jìn)行相似度評價。

1.5 體外抗腫瘤藥效評價

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞株HGC-27細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上清液，分別用0.1 g·mL-1、0.75 g·mL-1、0.50 g·mL-1、0.25 g·mL-1、0.10 g·mL-1（生藥）的仙鶴草根、莖、葉、花含藥培養(yǎng)液（0.1%DMSO助溶）刺激HepG2細(xì)胞、HGC-27細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞24 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，4 h后棄上清液，加入150 μLDMSO，震蕩溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀492 nm波長下測定吸光度（OD），計算細(xì)胞增值抑制率，并使用SPSS 17.0計算半數(shù)有效濃度（IC50）[6]。

1.6 體外抗氧化活性評價

1.6.1 DPPH法

參照文獻(xiàn)[7]，以Vc為陽性對照，在96孔板中分別加入100 μL 20.0 mg·mL-1、15.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1（生藥）的供試品溶液和100 μL DPPH（2×10-4mol·L-1）自由基工作液，振蕩均勻，室溫、避光靜置30 min，測定溶液在517 nm處的吸光值，每組平行設(shè)3個復(fù)孔。按如下公式計算供試品的自由基清除率，并計算出IC50值。

Asample為供試品與DPPH反應(yīng)液作用后的吸光度；Acontrol為溶劑50%乙醇與DPPH反應(yīng)液作用后的吸光度。

1.6.2 ABTS法

參照文獻(xiàn)[8]，精密稱取ABTS和K2S2O8適量，使用去離子水將其分別溶解并轉(zhuǎn)入容量瓶中混合，定容使其終濃度分別為7.00和2.45 mmol·L-1，在室溫、避光條件下反應(yīng)12 h，得到ABTS儲液。用前以PBS（pH7.4）稀釋成在734 nm波長下吸光度為0.7±0.02的工作液。以Vc為陽性對照，在96孔板中分別加入2 μL 20 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1（生藥）的供試品溶液和180 μLABTS工作液，振蕩均勻，室溫、避光靜置6 min，測定溶液在734 nm處的吸光值，每組平行設(shè)3個復(fù)孔。計算供試品的自由基清除率，并計算出IC50，ABTS自由基清除率的計算公式與DPPH法一致。

1.7 對凝血酶原（PT）的影響

昆明種小鼠60只（雄性，20-22 g），隨機(jī)分為空白對照組，陽性組，仙鶴草根、莖、葉、花組，共6組，每組10只，置于通風(fēng)條件下，自由飲水飲食。空白對照組灌胃給予生理鹽水0.1 mL·10 g-1，仙鶴草根、莖、葉、花組以0.01 g生藥·g-1灌胃，每日給藥1次，連續(xù)3天，眼球取血0.45 mL置于肝素鈉處理的離心管中，3000 r·min-1離心15 min，收集血漿。按試劑盒的要求進(jìn)行凝血酶原（PT）的測定。

圖1 仙鶴草不同藥用部位指紋圖譜（S1根，S2莖，S3葉，S4花，R軟件生成對照指紋圖譜）

表1 指紋圖譜相似度結(jié)果

表2 仙鶴草不同用藥部位對癌細(xì)胞株增殖的影響（n=3）

2 實驗結(jié)果

2.1 仙鶴草藥材不同藥用部位指紋圖譜及相似度計算結(jié)果

仙鶴草不同藥用部位指紋圖譜與對照圖譜（圖1），相似度計算結(jié)果（表1）。從指紋圖譜峰面積及數(shù)量、相似度計算結(jié)果可以看出，仙鶴草不同藥用部位的化學(xué)成分存在較大差異。

2.2 仙鶴草藥材不同藥用部位體外抗腫瘤藥效結(jié)果

仙鶴草仙鶴草藥材不同藥用部位作用HepG2細(xì)胞、HGC-27細(xì)胞、Caco-2細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果（表1）。仙鶴草根、莖、葉、花對人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞株HGC-27細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞有不同程度的增殖抑制作用，莖對三種癌細(xì)胞株的增殖抑制作用最強(qiáng)。

2.3 仙鶴草藥材不同藥用部位體外抗氧化活性結(jié)果

DPPH是屬于極少在室溫下穩(wěn)定的自由基之一，DPPH有一個單電子，在517 nm有強(qiáng)的吸收。當(dāng)自由基被清除時吸光度下降，同時顏色變淺黃。ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卤谎趸赡G色的ABTS+，當(dāng)具有抗氧化活性的物質(zhì)加入到預(yù)先形成的ABTS+溶液中后，在抗氧化物質(zhì)的作用下ABTS+轉(zhuǎn)變成ABTS，這時溶液會發(fā)生褪色，在734 nm處的吸光度會下降，褪色程度取決于樣品的抗氧化活性和濃度，因此可以用于體外抗氧化活性的評價［9］。仙鶴草藥材不同藥用部位均顯示較強(qiáng)體外抗氧化活性，葉、花清除DPPH、ABTS自由基的能力強(qiáng)于根、莖，結(jié)果（表3）。

2.4 仙鶴草藥材不同藥用部位對凝血酶原影響的結(jié)果

與空白組比較，仙鶴草根、莖、葉組小鼠凝血酶原水平明顯降低（P＜0.01），提示仙鶴草藥材不同藥用部位均對降低凝血酶原水平有作用。其中，仙鶴草莖組和仙鶴草葉組效果更明顯。結(jié)果（圖2）。

3 討論

《神農(nóng)本草經(jīng)百種錄》：“凡藥之用……各以其所偏勝而即資之療疾，故能補(bǔ)偏救弊，調(diào)和臟腑”，藥物的不同藥用部位偏勝不同，入藥也存在差異，縱觀歷代本草，對不同藥用部位性效的不同已有深入認(rèn)識?！稖罕静荨份d：“凡根之在土者，中半以上，氣脈之上行也，以生苗者為根；中半以下，氣脈之下行也，入土以為梢。病在中焦與上焦者，用根；在下焦者，用梢。根升而梢降。大凡藥根有上中下：人身半以上，天之陽也，用頭；在中焦用身；在身半以下，地之陰也，用梢。述類象形者也?！薄侗静莅l(fā)揮》謂：“當(dāng)知病在中焦用身，上焦用根，下焦用梢?！薄侗静菝审堋贩Q：“根梢各治，尤勿混淆。生苗向上者為根，氣脈行上；入土垂下者為梢，氣脈下行。中截為身，氣脈中守。上焦病者用根，中焦病者用身，下焦病者用梢。蓋根升梢降，中守不移故也［10］”。仙鶴草，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，即古時所稱的狼牙草，最早以根、根芽入藥，名牙子，狼牙，后擴(kuò)展至以全草入藥，稱狼芽草，2015版藥典載仙鶴草藥用部位為干燥地上部分，隨著現(xiàn)代中藥研究的不斷深入，同一植物，不同的藥用部位，由于性狀特點不同或主要成分的積累分布差異，導(dǎo)致不同藥用部位藥理藥效有一定差異[11-13]。因此，為了更好地利用仙鶴草藥材的藥用價值，有效開發(fā)藥材資源，本實驗對仙鶴草不同藥用部位的指紋圖譜進(jìn)行研究并進(jìn)行相似度評價，各藥用部位指紋圖譜的差異直觀而明顯，根和莖的色譜峰較為單一，色譜峰的數(shù)量與強(qiáng)度都少于花和莖，花和莖色譜圖的指紋信息較為豐富，具有各自的特征性，又具備一定的相似性，提示仙鶴草不同藥用部位的化學(xué)成分具有一定的差異性。

化學(xué)成分的不同導(dǎo)致不同藥用部位藥理效應(yīng)有一定差異[14]。本研究體外抗腫瘤實驗結(jié)果表明仙鶴草各藥用部位均顯示較強(qiáng)抗腫瘤、抗氧化藥效、抗凝血作用，其中莖抗人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞株HGC-27細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)于其根、葉、花三個部位，葉、花清除DPPH、ABTS自由基的作用強(qiáng)于根、莖兩個部位，莖、葉降低小鼠血漿凝血酶原水平作用強(qiáng)于根、花兩個部位，表明中藥藥用部位的不同，與用藥安全、療效關(guān)系緊密。隨著對仙鶴草的研究日益增多，抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎、止血降壓、抗瘧殺蟲等作用使其在臨床上被廣泛用于治療腫瘤、糖尿病、出血、梅尼埃病及陰道滴蟲病等病。同時因仙鶴草具有補(bǔ)虛扶正的藥效，使其單方或復(fù)方對治療內(nèi)外婦兒科等疾病都有著較好的療效，值得臨床推廣。藥效的深入研究使得其安全有效性成為關(guān)鍵前提，然而，目前對仙鶴草的藥用部位精準(zhǔn)應(yīng)用研究分析不夠深入，今后宜開展仙鶴草系統(tǒng)規(guī)范的藥用部位研究，觀察其臨床療效，以期更好地指導(dǎo)臨床合理用藥［15］。

表3 仙鶴草不同用藥部位清除DPPH、ABTS自由基結(jié)果（n=3）

圖2 仙鶴草不同藥用部位對凝血酶原的影響（n=10，*與空白組比較P＜0.01）

隨著中藥現(xiàn)代研究的不斷深入，中藥藥用部位的療效與成分也需得到進(jìn)一步研究。本實驗結(jié)果顯示仙鶴草藥材不同藥用部位的化學(xué)成分存在一定差異，同時抗腫瘤、抗氧化、抗凝血藥效實驗結(jié)果顯示治療不同病癥的最佳藥用部位也有所不相同，提示生藥治療不同疾病藥用部位不可一概而論，為仙鶴草藥材的合理使用提供科學(xué)依據(jù)，為生藥不同部位的精準(zhǔn)應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。