百合地黃湯對失眠模型大鼠行為學(xué)及不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響＊

鄭竹宏，趙仁云，丁玉婷，張 娜，孫玉杰，李劍豪，楊雨薇，孫毅坤

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

失眠是一種最常見的睡眠障礙性疾病，已經(jīng)成為十分普遍的現(xiàn)象[1]。失眠對人們的生活造成了嚴(yán)重困擾，也會誘導(dǎo)抑郁癥、高血壓和糖尿病等疾病的發(fā)生，嚴(yán)重者將導(dǎo)致死亡[2]。目前，用于治療失眠的藥物主要包括苯二氮卓類、非苯二氮卓類藥物、抗抑郁藥、抗組胺藥等，但具有反彈性失眠、成癮、戒斷等嚴(yán)重的副作用[3]。

百合地黃湯始載于《金匱要略》，由百合7枚和生地黃汁1升組成。原書云：“百合病者，百脈一宗，悉致其病也。意欲食復(fù)不能食，常默然。欲臥不能臥，

欲行不能行，飲食或有美時(shí)，或有不用聞食臭時(shí)，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)”[4]。

百合病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上的失眠比較相似。臨床上用百合地黃湯或其加減方治療失眠也取得了很好的療效[5-8]。但百合地黃湯治療失眠的作用機(jī)制研究較少，筆者通過研究百合地黃湯對失眠模型大鼠行為學(xué)、睡眠以及不同腦區(qū)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討其治療失眠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠（200±20 g），購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)-2011-0004。大鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，溫度和濕度保持恒定，光照12 h黑白循環(huán)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥物與試劑

百合（產(chǎn)地江蘇，批號：160926003）、生地黃（產(chǎn)地河南，批號：160503005）均購于北京康源祥瑞醫(yī)藥科技有限公司，多巴胺（DA，批號：100070-201507）購于中國食品藥品檢定研究院，5-羥色胺（5-HT，批號：BO1022DA14）、對氯苯丙氨酸（PCPA，批號：S42561）均購于上海源葉生物科技有限公司，地西泮（批號：國藥準(zhǔn)字H11020898）購于北京益民藥業(yè)有限公司，戊巴比妥鈉（批號WS20060401）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。百合、地黃2:1，用12倍量50%乙醇溶液浸泡60min，回流提取90 min，提取2次，合并濾液，干燥，浸膏用水復(fù)溶，分別配制成含生藥量為4 g·mL-1和1 g·mL-1的百合地黃湯溶液，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

WT型電子天平（杭州萬特衡器有限公司），萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），GTR10-2型高速冷凍離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），DW-HL538型-86℃冰箱（中科美菱），勻漿機(jī)（北京市科學(xué)器材公司），Alliance 2695高效液相色譜儀，ECD 2465電化學(xué)檢測器。

1.4 造模與分組

SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，于每天早晨8:00腹腔注射PCPA混懸液（0.4 g·kg-1），連續(xù)2天。動(dòng)物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天也活動(dòng)不停，表明模型復(fù)制成功。取造模成功大鼠32只，隨機(jī)分成模型組、地西泮組和百合地黃湯高、低劑量組，另取未造模大鼠8只作為正常對照組。

1.5 給藥方法

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9,10]，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定百合地黃湯高、低劑量組大鼠分別灌胃給予28 g·kg-1、7g·kg-1百合地黃湯溶液；地西泮組大鼠灌胃給予0.92 mg·kg-1地西泮溶液[11-13]；空白組與模型組大鼠分別給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7天。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 曠場實(shí)驗(yàn)

于第6天給藥30 min后，大鼠在木箱中適應(yīng)1 min，記錄各組大鼠3 min內(nèi)橫跨格子數(shù)、站立次數(shù)、中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)以及糞便數(shù)。兩次實(shí)驗(yàn)之間，清洗場箱內(nèi)壁及底面。

1.6.2 翻正反射實(shí)驗(yàn)

于末次給藥30 min后，各組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）。觀察并記錄大鼠睡眠潛伏期及睡眠持續(xù)時(shí)間，翻正反射消失為發(fā)生睡眠，翻正反射恢復(fù)為覺醒。

1.6.3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量

（1）樣本采集

于末次給藥24 h后，各組大鼠斷頭處死，冰浴上快速取出腦組織，迅速分離大鼠腦干、皮層和海馬組織，置-80℃冰箱中保存，備用。

（2）蛋白沉淀劑的制備

取乙二胺四乙酸二鈉0.0113 g、亞硫酸鈉0.0062 g，高氯酸858μL，置于100 mL量瓶中，稀釋至刻度，即得蛋白沉淀劑。4℃、避光保存，備用。

（3）大鼠腦干、皮層和海馬勻漿樣本制備

精密稱取大鼠腦干、皮層、海馬樣品0.1g，置于2mL離心管中，加入3倍量蛋白沉淀劑，冰浴條件下勻漿，靜置30 min，4℃、12000 r·min-1離心15 min，取上清，即得。

（4）對照品儲備液的配制

精密稱取DA和5-HT對照品各5 mg，分別置于5 mL量瓶中，用蛋白沉淀劑稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為1 mg·mL-1的對照品儲備液。臨用前用蛋白沉淀劑稀釋，配制成DA濃度分別為0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.48、0.96 μg·mL-1，5-HT濃度分別為0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.80 μg·mL-1的系列混合對照品溶液。

（5）色譜條件

色譜柱為Atlantis C18色譜柱（2.1×150 mm,3 μm），流動(dòng)相為甲醇和緩沖鹽溶液，其中緩沖鹽包括50 mmol·L-1檸檬酸-乙酸鈉，pH 3.5，內(nèi)含1 mmol·L-1B8離子對試劑，1.8 mmol·L-1二正丁胺，0.3 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉。甲醇與緩沖鹽的比例為4:96，檢測電壓為+0.75 V，柱溫37 ℃，流速0.2 mL·min-1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果采用±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠體質(zhì)量的影響

于末次腹腔注射PCPA 24 h后，計(jì)算大鼠體質(zhì)量增長值，與空白組相比，其余各組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），在一定程度上表明成功復(fù)制失眠模型。于末次給藥24 h后，計(jì)算大鼠體質(zhì)量增長值，與模型組相比，地西泮組和百合地黃湯高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯升高（P ＜ 0.05）（表1）。

2.2 對大鼠曠場行為評分的影響

與空白組相比，模型組大鼠得分明顯降低（P＜0.05），模型組大鼠的中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)和糞便顆粒明顯升高（P＜0.05），表明模型組大鼠比較緊張，在一定程度上反映成功復(fù)制失眠模型。與模型組相比，各治療組大鼠得分有上升趨勢，地西泮組和百合地黃湯高、低劑量組大鼠的中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)和糞便顆粒數(shù)明顯降低（P＜0.05），各給藥組可以緩解大鼠的緊張程度，具有鎮(zhèn)靜催眠的作用（表2）。

2.3 對大鼠睡眠時(shí)間的影響

與空白組相比，模型組大鼠睡眠潛伏期明顯延長（P＜0.05），在一定程度上表明成功復(fù)制失眠模型。與模型組相比，地西泮組、百合地黃湯高、低劑量組大鼠睡眠潛伏期明顯縮短（P＜0.05），百合地黃湯高、低劑量組大鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間明顯延長（P＜0.05），可直觀反映給藥組大鼠的睡眠有所改善（表3）。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

取含0.3 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉，0.5 mmol·L-1亞硫酸鈉的0.1mol·L-1高氯酸溶液，進(jìn)樣5μL，作為陰性對照。取濃度為1 μg·mL-1的混合對照品溶液，進(jìn)樣5 μL。取樣品溶液，進(jìn)樣5 μL（圖1）。

2.4.2 檢測限和定量限試驗(yàn)

分別取濃度為1 μg·mL-1的DA和5-HT對照品溶液，用蛋白沉淀劑進(jìn)行稀釋，檢測限S/N≥3，定量限S/N≥10。DA的檢測限和定量限分別為0.025 ng、0.075 ng；5-HT的檢測限和定量限分別為0.07 ng、0.1175 ng。

但省醫(yī)院并不滿足于此。在分管領(lǐng)導(dǎo)何斌副院長支持下，醫(yī)院維保服務(wù)規(guī)范化招標(biāo)采購繼續(xù)融入信息化思維，全院采購一體化智能管控系統(tǒng)，即將全鏈條構(gòu)建完成并上線使用。

2.4.3 線性關(guān)系考察

取不同濃度的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。DA回歸方程為

線性范圍為0.15-4.8 ng；5-HT回歸方程為

線性范圍為0.125-4.00 ng。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將對照品溶液和樣品溶液在4℃條件下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h測定，計(jì)算RSD%；對照品溶液的RSD%在1.12%-2.50%之間，樣品溶液的RSD%在3.51%-5.47%之間，對照品溶液和樣品溶液穩(wěn)定性均良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

分別配制高、中、低濃度的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定并計(jì)算RSD%，高、中、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的日內(nèi)精密度在0.26-0.98%之間，日間精密度在2.18-5.33%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度均良好。

表1 大鼠在造模后與給藥后體的變化,n=8)

表1 大鼠在造模后與給藥后體的變化,n=8)

注：與空白組比較，*P＜0.05，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

治療后40.00±4.17 28.63±11.73*43.00±6.61##49.13±23.42#37.25±9.13組別空白組模型組地西泮組高劑量組低劑量組體質(zhì)量變化/g造模后10.63±4.60-29.25±8.73***-24.63±10.31***-29.63±10.42***-28.38±4.78***

表2 曠場實(shí)驗(yàn)得分,n=8)

表2 曠場實(shí)驗(yàn)得分,n=8)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

糞便顆粒數(shù)2.75±1.75 4.33±2.34*2.13±0.99#0.75±0.71##1.00±1.41##組別空白組模型組地西泮組高劑量組低劑量組得分21.13±10.75 2.88±2.95*6.50±5.50 6.50±4.99 19.13±21.46中央格停留時(shí)間3.63±2.13 76.38±36.75*3.25±1.91#3.00±1.51#2.75±2.12#修飾次數(shù)0.25±0.46 2.75±1.59**0.50±0.76#0.00±0.00##0.88±0.64#

表3 地西泮與百合地黃湯對失眠大鼠睡眠的影響n=8)

表3 地西泮與百合地黃湯對失眠大鼠睡眠的影響n=8)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

睡眠時(shí)間/min 52.25±6.69 65.75±19.47 65.75±12.76 113.71±23.78#94.25±24.92#組別空白組模型組地西泮組高劑量組低劑量組睡眠潛伏期/s 637.50±143.20 885.00±280.97*352.50±117.56###385.74±106.37##570.00±207.51#

圖1 A：陰性對照 B：混合對照品 C：樣品

表4 加樣回收率結(jié)果

表5 各組大腦皮層中DA和5-HT的含量(s,n=8)

表5 各組大腦皮層中DA和5-HT的含量(s,n=8)

注：與空白組比較，***P＜0.001；與模型組比較，##P＜0.01，###P ＜0.001。

5-HT/(ng·g-1)172.10±20.26 87.86±15.76***124.95±22.77##90.66±11.70 140.74±19.82###組別空白組模型組地西泮組高劑量組低劑量組DA/(ng·g-1)427.59±112.26 904.66±260.20***930.05±148.78 166.37±80.61###78.65±25.17###

表6 各組大鼠腦干中DA和5-HT的含量(s,n=8)

表6 各組大鼠腦干中DA和5-HT的含量(s,n=8)

注：與空白組比較，***P ＜0.001；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P＜0.001。

5-HT/(ng·g-1)555.76±173.35 384.02±41.26***545.40±53.85###440.21±22.10##428.69±48.45#組別空白組模型組地西泮組高劑量組低劑量組DA/(ng·g-1)72.03±22.50 99.59±8.63***105.63±10.05 95.07±6.58 109.50±13.72

表7 各組大鼠海馬中DA和5-HT的含量s,n=8)

表7 各組大鼠海馬中DA和5-HT的含量s,n=8)

注：與空白組比較，***P＜0.001；與模型組比較，##P＜0.01，###P ＜0.001。

5-HT/(ng·g-1)488.29±36.18 260.77±45.33***458.00±124.13##486.75±63.27###363.63±48.99###組別空白組模型組地西泮組高劑量組低劑量組DA/(ng·g-1)195.65±74.82 211.15±54.21 209.26±24.19 227.11±66.36 165.32±26.83

2.4.6 回收率試驗(yàn)

取樣品9份，分別加入高、中、低3種濃度的對照品溶液，再按樣品處理方法操作，平行測定3份樣品，計(jì)算平均回收率（表4）。高、中、低濃度樣品的平均回收率在94.39-108.36%之間，回收率良好。

2.5 各組大鼠皮層中DA和5-HT的含量

與空白組比較，模型組大鼠皮層中DA含量顯著升高（P＜0.01），5-HT含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，百合地黃湯高、低劑量組大鼠皮層中DA含量顯著降低（P＜0.01），地西泮組和百合地黃湯低劑量組大鼠皮層中5-HT含量顯著升高（P＜0.01）（表5）。

2.6 各組大鼠腦干中DA和5-HT的含量

與空白組比較，模型組大鼠腦干中DA含量顯著升高（P＜0.01），5-HT含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦干中DA含量無明顯變化，地西泮組和百合地黃湯高、低劑量組大鼠腦干中5-HT含量明顯升高（P＜0.05）（表6）。

2.7 各組大鼠海馬中DA和5-HT的含量

與空白組比較，模型組大鼠海馬中DA含量無明顯變化（P＞0.05），5-HT含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，地西泮組和百合地黃湯高、低劑量組大鼠海馬中5-HT含量顯著升高（P＜0.01）（表7）。

3 討論

目前，治療失眠的實(shí)驗(yàn)研究主要從動(dòng)物行為學(xué)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等方面入手[14]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對于睡眠的調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的作用[15]，大鼠皮層、腦干和海馬中都含有與睡眠密切相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[16]。研究表明5-HT是一種促進(jìn)睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)[17,18]，主要分布于大腦皮層和神經(jīng)突觸[19]，PCPA是5-HT的合成酶抑制劑，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20]，大鼠腹腔注射PCPA可明顯抑制大鼠腦內(nèi)5-HT的合成，致使睡眠晝夜節(jié)律消失，近乎達(dá)到完全失眠；DA是一種興奮性遞質(zhì)，濃度升高可導(dǎo)致失眠[21]。本實(shí)驗(yàn)主要針對百合地黃湯對失眠模型大鼠行為學(xué)、睡眠時(shí)間以及不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射PCPA復(fù)制失眠模型，以翻正反射實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)和大鼠體質(zhì)量變化為指標(biāo)以確定造模成功與否。模型組大鼠與空白組大鼠相比較，體質(zhì)量、曠場得分、中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)、糞便顆粒數(shù)以及睡眠潛伏期等指標(biāo)的變化，均在一定程度上反映成功復(fù)制失眠模型。各治療組大鼠的中央格停留時(shí)間、修飾次數(shù)和糞便顆粒數(shù)均明顯降低，表明百合地黃湯可以改善大鼠行為學(xué)。各治療組大鼠睡眠潛伏期縮短，且百合地黃湯組大鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間延長，表明百合地黃湯可以縮短睡眠潛伏期并延長睡眠持續(xù)時(shí)間，且效果優(yōu)于地西泮組。百合地黃湯組大鼠皮層中DA含量明顯降低，在一定程度上反映百合地黃湯可能通過調(diào)節(jié)DA含量治療失眠；地西泮組和百合地黃湯低劑量組大鼠皮層、腦干和海馬中5-HT含量均明顯升高，百合地黃湯高劑量組大鼠腦干和海馬中5-HT含量升高，表明百合地黃湯可能通過調(diào)節(jié)5-HT，達(dá)到治療失眠的目的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，百合地黃湯溶液治療失眠的療效確切，且優(yōu)于地西泮，推測可能與百合地黃湯通過多途徑、多靶點(diǎn)治療失眠有關(guān)。各治療組對大鼠皮層中5-HT含量的調(diào)節(jié)作用最為明顯，與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。百合地黃湯能夠改善失眠模型大鼠行為學(xué)和睡眠，推測百合地黃湯對DA和5-HT的調(diào)節(jié)作用可能是其治療失眠的作用機(jī)制。已有研究表明[22,23]，百合中總皂苷及薯蕷皂苷、地黃中多糖及梓醇等成分均具有鎮(zhèn)靜催眠的作用，但其作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。