西藏馬鈴薯脫毒技術(shù)建立及不同世代繁育苗病毒分析

旦增旺姆

(西藏自治區(qū)日喀則市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，西藏 日喀則 857000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是無性繁殖作物，屬于茄科茄屬一年生草本植物，塊莖可供食用，全世界馬鈴薯栽培種植面積僅位于玉米、小麥、水稻之后，是世界上第四大糧食作物，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1-2]。西藏馬鈴薯栽培歷史悠久，其種植分布廣，在海拔1000～4600 m都有種植，主要分布在拉薩、日喀則、林芝、山南地區(qū)，其種植面積僅次于青稞，在西藏農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上占有重要的地位。西藏日喀則地區(qū)是西藏的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)[3]，種植面積從20世紀(jì)90年代初的60 hm2擴(kuò)大到2017年的7200 hm2，占西藏馬鈴薯總種植面積的45 %。馬鈴薯在生產(chǎn)過程中，易受多種病毒的侵染。在生產(chǎn)上常見的馬鈴薯病毒有馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)以及馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)等，如果用帶病毒塊莖作種薯，病毒在塊莖中積累，最后使種薯喪失種用價值而大幅度減產(chǎn)。而馬鈴薯脫毒可恢復(fù)其原來的生長發(fā)育特性。自2003年以來，西藏開展脫毒馬鈴薯研究和應(yīng)用，但至今西藏馬鈴薯脫毒技術(shù)體系不完善，本文基于西藏日喀則農(nóng)科所的多年研究，擬就該技術(shù)體系作一詳盡敘述，同時對不同世代繁育苗病毒積累情況做一簡要檢測分析，以期更好的為西藏馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)提供技術(shù)支持，進(jìn)而指導(dǎo)大田生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 莖尖脫毒技術(shù)建立

本試驗選用脫毒馬鈴薯0901和0902脫毒苗(備注：0901、0902均為脫毒之后進(jìn)行大田生產(chǎn)再選單株進(jìn)行莖尖剝離獲得組培苗)用血清學(xué)中最常用的酶聯(lián)免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)進(jìn)行病毒檢測，通過研究脫毒馬鈴薯再次感染病毒的機(jī)理，研究不同品種脫毒馬鈴薯的再次侵染病毒環(huán)節(jié)和過程并找出相對的防治措施使之不再侵染。

本試驗以西藏日喀則市自治區(qū)薯類脫毒中心提供的脫毒馬鈴薯新品種0901和0902為試驗材料。試驗儀器：培養(yǎng)皿、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、剪刀、接種針、接種刀、酒精燈、75 %酒精、95 %酒精、基質(zhì)床、霧培床、燒杯、吸水紙、記號筆、封口袋、量筒、可調(diào)移液槍：1000, 10～200,100 μl;槍頭(Tip槍頭)、冰箱。

挑選大田生產(chǎn)的脫毒馬鈴薯0901、0902的單株進(jìn)行莖尖剝離，培養(yǎng)成組培苗。

將種薯芽萌發(fā)至2～3 cm時，選取粗壯的芽進(jìn)行消毒(芽在自來水中沖洗20 min去掉泥沙，再用75 %酒精泡30s去表面張力，用無菌水沖洗1次，再用0.1 %HgCl泡15 min，再用無菌水沖洗3次)。之后莖尖在超凈工作臺在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)б粋€葉原基的莖尖，將生長點(diǎn)迅速接種在加生長素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行莖尖培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基配方如下。莖尖培養(yǎng)基配制：MS(蔗糖30 g/L)+NAA(0.02 mg/L)+6BA(0.5 mg/L)。

1.2 脫毒苗繁育技術(shù)建立

1.2.1 組培苗的擴(kuò)繁技術(shù)建立 將莖尖發(fā)育成3至4葉片的小植株時可進(jìn)行擴(kuò)繁。挑選無污染、較健壯的組培苗在超凈工作臺上按單莖切段，每個莖節(jié)帶一片小葉接種在普通MS培養(yǎng)基中，用接種針將每個莖段的下部埋入培養(yǎng)基中。一個培養(yǎng)皿定植10～13根，一共切繁60合格無污染瓶(每個代號分別30瓶)。組培苗培養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，光照強(qiáng)度2000～3000 lx,光照時間16 h/d。培養(yǎng)15～20 d，苗長出5葉、5 cm以上即可移栽至溫室。

1.2.2 脫毒苗基質(zhì)繁育技術(shù)建立 基質(zhì)栽苗：基質(zhì)床苗 底層鋪羊糞或草炭，其上鋪蛭石與有機(jī)肥混合基質(zhì)。將每個代號組培苗各20瓶共40瓶拿到基質(zhì)以10 cm×10 cm的株行距進(jìn)行栽培。

試管苗在基質(zhì)移栽前2～3 d對其的馴化，將其溫度和光照逐漸適應(yīng)室外條件。然后在已消毒完好的基質(zhì)溫室里進(jìn)行移栽(幼苗按5 cm×8 cm的株行距，2 cm的深度將把幼苗根部輕埋在基質(zhì)里稍作壓實(shí)。)，控制好溫室溫濕度(濕度控制：移栽初期搭建小拱棚，將把幼苗生長濕度保持在80 %～90 %左右，白天每5 h進(jìn)行通風(fēng)換氣一次，約21 d后扯掉小拱棚，將室內(nèi)濕度控制在60 %左右，幼苗避免陽光直射。溫度控制：幼苗移栽之后將溫室內(nèi)白天溫度控制在23～26 ℃，夜間不低于10～15 ℃，另外室外太陽光強(qiáng)時溫室需要遮陽，避免室內(nèi)溫度過高出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象。)。另外，在基質(zhì)苗生長期間提供足夠的肥料條件和防治病蟲害。

1.2.3 脫毒苗霧培栽培技術(shù)建立 霧培栽培：將馬鈴薯根系在黑暗和無土的條件下，通過借助機(jī)械電子設(shè)備將營養(yǎng)液定時定量的噴霧，并提供植株所需要的水分和養(yǎng)分。

由于西藏特殊的氣候條件，將試管苗在基質(zhì)栽培30～45 d左右后可以假植到霧培，移栽苗在假植前2～3 d停止?jié)菜悦庵仓昵宕?，起苗時容易折斷傷苗。移栽苗假植可以通過整株移栽和莖切扦插兩種方式進(jìn)行移栽，在霧培移栽苗期最適溫度白天20～28 ℃，晚上10～17 ℃，溫度不能低于10 ℃，室內(nèi)最適濕度要控制在60 %～80 %左右。本試驗選用整株移栽方式進(jìn)行假植，每個代號各100株共200株。

1.3 病毒檢測技術(shù)建立及不同時代脫毒苗病毒分析

病毒檢測技術(shù)建立。而馬鈴薯病毒檢測技術(shù)有生物試驗方法、血清學(xué)方法和核酸分子檢測技術(shù)這三大類[4]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測不同品種馬鈴薯的病毒，而酶聯(lián)免疫法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于大規(guī)模檢測，是目前最常用的血清學(xué)方法之一，該方法普遍應(yīng)用于病毒檢測、病毒血清學(xué)關(guān)系測定和定量分析等[5]。在生產(chǎn)上檢測馬鈴薯病毒的方法主要有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(double Anibody Sandwith Enzyme Linked Immunsorbent Assy,DAS-ELISA)，三抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Triple Anibody Sandwith Enzyme Linked Immunsorbent Assy,TAS-ELISA)和硝酸纖維素膜-酶聯(lián)免疫吸附法(Nitrocellulose Membrane Enzyme Linked Immunsorbent Assy,NCM-ELISA)[6]。而雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)是一種傳統(tǒng)的植物檢測技術(shù)，在馬鈴薯病毒檢測中有其獨(dú)到的應(yīng)用[7]。為了加快反應(yīng)速度，節(jié)省時間，白艷菊等[8]在常規(guī)DAS-ELISA方法基礎(chǔ)上做了兩方面的改進(jìn)：第一，由常規(guī)ELISA在一塊板上一種酶標(biāo)記一種抗體改為同塊板上幾種酶對應(yīng)標(biāo)記幾種抗體(以PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV為例)；第二，DAS-ELISA各種反應(yīng)均在恒溫?fù)u床中進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了快速同時檢測多種馬鈴薯病毒。宋吉軒[9]分別用改進(jìn)DAS-ELISA法和常規(guī)DAS-ELISA法對馬鈴薯4種主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果完全一致，切靈敏也基本相同。

本試驗采用改進(jìn)DAS-ELISA法快速檢測4種PVX、PVY、PVS、PLRV主要病毒。每個處理設(shè)3個水平，1個水平3次重復(fù)。2個品種代號0901和0902，分別設(shè)組培苗a、基質(zhì)苗b、霧培苗c 3個繁苗世代水平，每個水平的病毒檢測苗子按抽樣方式進(jìn)行3次重復(fù)。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(DAS-ELISA)檢測馬鈴薯PVX、PVY、PVS、PLRV四種病毒的方法如下：①配制緩沖液和沖洗液。配制T wash buffer 沖洗緩沖液：用50 g PBST﹢950 mL無菌水或一包PBS-Tween (50 mL)﹢950 mL無菌水定容到1000 mL。配制EXTRACT buffer提取緩沖液GEB:①稱取16.5 g buffer powder 用無菌水溶解，定容到500 mL。在GEB緩沖液里加10 mL Tween-20,混勻。②每樣材料稱取0.15 g，加1.5 mL提取緩沖液，研磨。③點(diǎn)樣 每孔加入100 μl樣品提取液，一個樣品3次重復(fù)，留6孔(3個陽性3個空白，空白加緩沖液)。4 ℃冰箱過夜。④洗板 樣品倒出去，用沖洗緩沖液每孔加200 μl沖洗7次，3 min/次。⑤配制結(jié)合酶標(biāo)抗體溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。點(diǎn)樣 取100 μl結(jié)合抗體，每孔加100 μl，裝濕盒，室溫2 h。⑥洗板 樣品倒出去，用沖洗緩沖液每孔加200 μl沖洗8次，3 min/次。⑦配制底物溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存)。點(diǎn)樣 每孔加100 μl底物溶液，裝濕盒，室溫1 h。⑧顯色。

2 結(jié)果與分析

從表1 可以看出，脫毒馬鈴薯0901在網(wǎng)室不同世代繁育后再次發(fā)現(xiàn)了病毒，且病毒種類和感染程度均不一樣。在組培苗擴(kuò)繁中發(fā)現(xiàn)了PVS病毒，在基質(zhì)和霧化栽培種中分別發(fā)現(xiàn)了PVS、PVY病毒，并且強(qiáng)度較強(qiáng)。說明在脫毒苗繼代培養(yǎng)過程中，組培苗擴(kuò)繁由于操作不當(dāng)、或環(huán)境因素，也會再次感染病毒；在脫毒種薯繁育過程中，不注意病蟲害防治，也會再次感染病毒，霧培法生產(chǎn)原原種，由于脫毒苗浸泡在水里，再次感染病毒幾率更大。

表1 馬鈴薯0901品種不同世代繁育苗病毒分析

注： a、b、c分別為組培苗、基質(zhì)苗、霧培苗。“-”為陰性，“+”為陽性，“++”為強(qiáng)陽性。

表2 馬鈴薯0902品種不同世代繁育苗病毒分析

注： a、b、c分別為組培苗、基質(zhì)苗、霧培苗?！?”為陰性，“+”為陽性，“++”為強(qiáng)陽性。

從表2可以看出,馬鈴薯0902在脫完毒之后脫毒苗在各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)沒有發(fā)現(xiàn)病毒。

通過對不同品種不同世代繁育苗病毒檢測結(jié)果可以看出，由于不同品種抗病強(qiáng)度不同，脫毒試管苗和種薯生產(chǎn)過程中再次感染病毒的程度也不同。馬鈴薯0902品種的抗病性強(qiáng)于馬鈴薯0901。這也為品種抗病性評價提供了另一參考方面。

3 結(jié) 語

馬鈴薯在脫毒完成后進(jìn)行種植時還會再次感染病毒，不同品種在不同世代繁育時由于品種特性不同，各繁育環(huán)節(jié)會表現(xiàn)出不同的病毒積累特征和田間表現(xiàn)。如通過組培苗擴(kuò)繁操作不到位、基質(zhì)霧培生產(chǎn)過程中隔離不到位、基質(zhì)槽和霧培槽消毒不干凈等因素也可能會再次侵染病毒。大田生產(chǎn)過程中通過土傳病害或者蚜蟲和空氣傳播方式也會再次感染病毒；不同品種的馬鈴薯由于抗病強(qiáng)度不同，在每個環(huán)節(jié)侵染病毒種類及侵染的深度也不一樣。因此，在脫毒馬鈴薯生產(chǎn)過程中必須選用比較健康、抗病性強(qiáng)的植株進(jìn)行莖尖脫毒，這在種薯生產(chǎn)體系中尤為關(guān)鍵；脫毒馬鈴薯在生產(chǎn)過程中也要注意病毒檢測，可以隨機(jī)選取植株進(jìn)行檢測，生產(chǎn)中每年病毒檢測不少于3次，這樣可以確保生產(chǎn)中脫毒馬鈴薯種薯田脫毒檢測和監(jiān)測到位，提高種薯質(zhì)量。