普羅布考對(duì)腎小管上皮細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷的影響及其機(jī)制研究

任廣偉，龔淼，李明明，牛哲莉，楊洪娟，孫利軍*

氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）細(xì)胞模型多被用于在細(xì)胞水平上模擬急性缺血-再灌注（I/R）損傷的過(guò)程，應(yīng)用此模型可進(jìn)行藥物保護(hù)作用與機(jī)制的研究和治療靶向的探討［1］。腎I/R 是導(dǎo)致急性腎損傷的常見原因［2］，研究發(fā)現(xiàn)，腎I/R 損傷引起腎小管上皮細(xì)胞死亡的主要方式是壞死與鐵死亡，其主要機(jī)制是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化［3-5］。普羅布考是具有很強(qiáng)抗氧化作用的降血脂藥［6］，多項(xiàng)研究表明，普羅布考可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，具有較好的組織或細(xì)胞保護(hù)作用［7］。目前，尚未見到關(guān)于普羅布考對(duì)OGD/R 引起的人腎小管上皮細(xì)胞株（HK-2）損傷影響的報(bào)道。為此，本研究通過(guò)建立HK-2 的OGD/R 模型模擬腎小管上皮細(xì)胞的I/R 損傷，研究普羅布考對(duì)HK-2 損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為尋找新的治療方向提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2017年12月—2018年9月。

1.2 細(xì)胞株與主要試劑 HK-2（中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心），普羅布考、凋亡抑制劑（Z-VADFMK）、鐵死亡抑制劑（Fer-1）、壞死性凋亡抑制劑、自噬抑制劑（3-methyladenine）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）活性檢測(cè)試劑盒（Sigma 公司），兔抗GPX4 單克隆抗體（sc-166120）、兔抗β-actin 單克隆抗體（sc-58673）（Santa Cruz 公司），噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)分析試劑盒和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 OGD/R 模型的建立方法 參照WEI 等［1］的方法常規(guī)培養(yǎng)HK-2 至完全貼壁，用缺血模擬溶液（包括5.37 mmol/L KCl、136.89 mmol/L NaCl、0.44 mmol/L KH2PO4、0.338 mmol/L Na2HPO4、4.166 mmol/L NaHCO3和5 mmol/L D-葡萄糖，pH 值為6.8）代替常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞放入含5% CO2和95% N2的密閉容器，將密閉容器放入缺氧培養(yǎng)箱（5% CO2、1% O2和94% N2）于37 ℃培養(yǎng)2 h 模擬缺血缺氧條件，2 h 后用常規(guī)培養(yǎng)液替換缺血模擬溶液在37 ℃、5% CO2正常條件下培養(yǎng)3 h 模擬復(fù)氧過(guò)程。

1.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定普羅布考最佳作用時(shí)間與濃度 取HK-2，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)6×105/L，將細(xì)胞接種到96 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，待細(xì)胞完全貼壁后將其分為正常對(duì)照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組。正常對(duì)照組不予處理，OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組進(jìn)行OGD/R 模型的建立，之后OGD/R 組不予處理，OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組分別加入25、50、100 μmol/L 普羅布考。分別于12、24、48 h 時(shí)，采用噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，利用酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各組吸光度值（A 值），計(jì)算細(xì)胞增殖活性〔細(xì)胞增殖活性（%）=實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值×100%〕，確定普羅布考最佳作用時(shí)間與濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本研究?jī)r(jià)值：

腎缺血-再灌注（I/R）損傷的主要病理生理基礎(chǔ)是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，而腎小管上皮細(xì)胞損傷直接影響尿液的形成。普羅布考曾經(jīng)是臨床上常用藥，逐漸被新藥所取代。本研究首次將普羅布考應(yīng)用于腎小管上皮細(xì)胞急性I/R 模型的處理，觀察普羅布考的作用靶點(diǎn)，不僅為腎I/R 損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其他器官的I/R 損傷治療提供新思路。

1.5 正式實(shí)驗(yàn)分組 取HK-2，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)3×105/L，將細(xì)胞接種到96 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，待細(xì)胞完全貼壁后將其分為正常對(duì)照組（不予處理）、OGD/R 組（建立OGD/R模型）、普羅布考組（給予最佳作用濃度的普羅布考）、OGD/R+普羅布考組（建立OGD/R 模型后給予最佳作用濃度的普羅布考）。

1.6 觀察細(xì)胞形態(tài) 于普羅布考最佳作用時(shí)間，采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.7 LDH 釋放法檢測(cè)LDH 活性 于普羅布考最佳作用時(shí)間，取出培養(yǎng)板400 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），將各孔內(nèi)上清液吸干凈，加入150 μl 用PBS稀釋10 倍的LDH 釋放工作液，輕搖混勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h 后取出，400 r/min 離心5 min（離心半徑 15 cm），每孔取上清液120 μl 加入新的96 孔板，每孔加入60 μl LDH 檢測(cè)工作液，輕搖混勻，室溫避光孵育30 min，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。檢測(cè)的吸光度越大說(shuō)明LDH 活性越強(qiáng)，故用吸光度表示LDH 活性。

1.8 MDA 試劑盒檢測(cè)MDA 水平和酶促法檢測(cè)GPX 活性 于普羅布考最佳作用時(shí)間，取各組細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，放入不同離心管內(nèi)冰上裂解細(xì)胞，裂解完成后將各組離心管放入低溫離心機(jī)4 ℃ 1000 r/min離心20 min（離心半徑15 cm），取各組上清液作為檢測(cè)用細(xì)胞蛋白勻漿，一部分上清液嚴(yán)格按照MDA 試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行MDA 水平檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)6 次；另一部分上清液放入96 孔板內(nèi)，依次加入檢測(cè)緩沖液和檢測(cè)工作液，輕搖混勻后每孔加入5 μl 有機(jī)過(guò)氧化物試劑（t-Bu-OOH）溶液進(jìn)行反應(yīng)，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，立即在340 nm 波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，隨后室溫下繼續(xù)反應(yīng)5 min，再次在340 nm 波長(zhǎng)處上機(jī)檢測(cè)吸光度，即GPX 活性。

1.9 生化法檢測(cè)GSH 水平 于普羅布考最佳作用時(shí)間，用細(xì)胞刮收集各組細(xì)胞移入離心管中，1200 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），離心2 次，去除上清液，向離心管內(nèi)加入蛋白去除試劑溶液，1000 r/min 離心 5 min（離心半徑15 cm），取上清液分別加入96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，依次加入檢測(cè)工作液，在410 nm 波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度，即GSH 水平。

1.10 Western blotting 法檢測(cè)GPX4 水平 于普羅布考最佳作用時(shí)間，取各組細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，蛋白上樣量調(diào)整為50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，加入3%牛血清清蛋白（BSA）室溫封閉2 h，去除封閉液后分別加入Tris-HCl 緩沖液（TBS）稀釋的GPX4（1∶200）、β-actin（1∶500）抗體，4 ℃孵育12 h，加入辣根酶過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶200），室溫孵育1 h，應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色并顯影。應(yīng)用Quantity One 軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，以GPX4/β-actin 表示GPX4 水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正常對(duì)照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組12、24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組12、24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性高于OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性高于本組12 h 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。由于用藥原則為在相似的作用下，一般選擇較低濃度及較短作用時(shí)間，因此采用50 μmol/L 普羅布考作用24 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞形態(tài) 正常對(duì)照組細(xì)胞呈三角形或多邊形，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞折光性良好，貼壁完全；OGD/R 組懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞皺縮體積減小，失去正常形態(tài)，折光性減弱；普羅布考組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，貼壁完整；OGD/R+普羅布考組懸浮細(xì)胞減少，細(xì)胞折光性較好（見圖1）。

2.3 LDH 活性 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R 組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH活性低于OGD/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R+普羅布考組LDH 活性高于普羅布考組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 MDA 水平、GPX 活性 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組MDA 水平、GPX 活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R 組、OGD/R+普羅布考組MDA 水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組MDA 水平低于OGD/R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R+ 普羅布考組MDA 水平高于普羅布考組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R組GPX 活性低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX活性高于OGD/R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R+普羅布考組GPX 活性低于普羅布考組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.5 GSH 水平 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GSH 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R 組GSH 水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GSH 水平高于OGD/R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 正常對(duì)照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of cell proliferation in normal control group，OGD/R group，OGD/R+25 μmol/L probucol group，OGD/R+50 μmol/L probucol group and OGD/R+100 μmol/L probucol group at different time points of intervention

表1 正常對(duì)照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of cell proliferation in normal control group，OGD/R group，OGD/R+25 μmol/L probucol group，OGD/R+50 μmol/L probucol group and OGD/R+100 μmol/L probucol group at different time points of intervention

注：OGD/R=氧糖剝奪/復(fù)氧；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05；與OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組比較，cP＜0.05；與本組12 h 比較，dP＜0.05

組別12 h24 h48 h正常對(duì)照組100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00 OGD/R 組50.23±1.52a51.68±1.26a49.28±1.39a OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組50.77±1.97a52.09±1.48a53.43±2.11a OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組53.52±1.83a 64.97±1.92abcd 67.89±1.68abcd OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組56.65±1.75a 65.31±1.54abcd 69.47±1.35abcd F 值59.02545.71436.245 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 GPX4 水平 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX4 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OGD/R 組GPX4 水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX4 水平高于OGD/R 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2、圖2）。

圖2 Western blotting 法檢測(cè)GPX4 水平的SDS-PAGE 圖Figure 2 SDS-PAGE picture of GPX4 level detected by Western blotting

表2 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平、GPX 活性、GSH 水平、GPX4 水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of LDH activity，MDA level，GPX activity，GSH level and GPX4 level in normal control group，OGD/R group，probucol group and OGD/R+probucol group

表2 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平、GPX 活性、GSH 水平、GPX4 水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of LDH activity，MDA level，GPX activity，GSH level and GPX4 level in normal control group，OGD/R group，probucol group and OGD/R+probucol group

注：LDH=乳酸脫氫酶，MDA=丙二醛，GPX=谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，GSH=谷胱甘肽；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05；與普羅布考組比較，cP＜0.05

組別LDH 活性（U/L）MDA（nmol/mg）GPX 活性（U/mg）GSH（mg/g）GPX4正常對(duì)照組97.65±9.432.33±0.02197.48±11.3225.17±0.020.53±0.01 OGD/R 組659.21±27.02a27.53±0.05a104.72±13.25a9.76±0.01a0.28±0.01a普羅布考組76.63±10.27b1.79±0.01b213.29±12.56b27.41±0.02b0.58±0.01b OGD/R+普羅布考組487.63±32.58abc12.31±0.02abc186.37±10.71bc26.59±0.02b0.54±0.02b F 值26.30732.85531.28340.05217.569 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 正常對(duì)照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure 1 Cell morphology in normal control group，OGD/R group，probucol group and OGD/R+probucol group

3 討論

臨床上，腎I/R 損傷通過(guò)引起急性腎小管壞死導(dǎo)致急性腎衰竭，目前尚無(wú)有效治療方法。已有研究證實(shí)，缺血后處理對(duì)腎I/R 損傷發(fā)揮一定保護(hù)作用［8］，其可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中的某些相關(guān)蛋白抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕腎臟損傷［9］。腎I/R 引起的正常腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變除了細(xì)胞凋亡與壞死，還包括細(xì)胞鐵死亡［10-12］。減輕腎I/R 損傷的治療靶點(diǎn)主要包括對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)和損傷改善作用。普羅布考最初的臨床應(yīng)用是作為降脂藥物，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)普羅布考還具有強(qiáng)抗氧化、抗炎與抗腫瘤活性，使其在臨床上作為強(qiáng)抗氧化劑應(yīng)用于防治心血管疾?。?3］。因此，本研究將HK-2 細(xì)胞株作為研究對(duì)象，應(yīng)用國(guó)際公認(rèn)的OGD/R 細(xì)胞模型，探討普羅布考對(duì)腎小管上皮細(xì)胞OGD/R 模型的作用及其可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞呈三角形或多邊形，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞折光性良好，貼壁完全；OGD/R組懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞皺縮體積減小，失去正常形態(tài)，折光性減弱；普羅布考組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，貼壁完整；OGD/R+普羅布考組懸浮細(xì)胞減少，細(xì)胞折光性較好；OGD/R 組12、24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性低于正常對(duì)照組。以上結(jié)果表明模型建立成功。OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組12、24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性低于正常對(duì)照組，OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性高于OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組，OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時(shí)細(xì)胞增殖活性高于本組12 h 時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞增殖活性對(duì)普羅布考具有劑量和時(shí)間依賴性，提示普羅布考可能對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。OGD/R 組LDH 活性、MDA 水平高于正常對(duì)照組，表明OGD/R 引起HK-2 細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化及LDH 活性升高，可能原因是腎臟急性缺血缺氧可引起活性氧簇（ROS）大量產(chǎn)生，超過(guò)細(xì)胞生物行為的需要，過(guò)量的ROS 作用于脂肪酸可以造成脂質(zhì)過(guò)氧化，而脂質(zhì)過(guò)氧化物可以改變細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致LDH 的釋放和活性增高。OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平高于正常對(duì)照組、普羅布考組，普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平低于OGD/R 組，而OGD/R 組GSH 水平低于正常對(duì)照組，普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GSH 水平高于OGD/R 組，提示普羅布考可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶類降低細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，進(jìn)而降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平抑制LDH 的活性。OGD/R 組GPX 活性、GPX4 水平低于正常對(duì)照組，提示OGD/R 引起GPX4 活性降低，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷加重；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX 活性、GPX4 水平高于OGD/R組，提示普羅布考可能直接或通過(guò)提高GPX 活性間接抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。本結(jié)果與SANTOS 等［14］的研究結(jié)果一致，該研究指出普羅布考的抗氧化作用主要包括兩方面：一是直接清除細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上的氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生；二是直接或間接提高內(nèi)源性抗氧化劑的儲(chǔ)備或激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系，發(fā)揮清除脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用，其中包括對(duì)GPX 的激活。

本研究結(jié)果還顯示，普羅布考在處理細(xì)胞12 h 以內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)明顯的保護(hù)作用，24 h 以后才逐漸提高細(xì)胞增殖活性，并呈時(shí)間依賴性，這一結(jié)果與普羅布考代謝緩慢的藥理學(xué)特性一致，本研究結(jié)果與WANG 等［15］的結(jié)果一致，該研究表明普羅布考的t1/2長(zhǎng)，其藥理作用在停藥后仍可維持?jǐn)?shù)月，因此，在臨床應(yīng)用中普羅布考可作為預(yù)防用藥。

由于腎I/R 引起的腎小管上皮細(xì)胞死亡是一個(gè)多因素作用的病理生理過(guò)程，普羅布考對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能不僅限于抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，還有其他靶點(diǎn)和途徑，本研究具有一定局限性。在今后的研究中，本研究將進(jìn)一步探討普羅布考對(duì)模型細(xì)胞死亡途徑的影響，以期為腎小管上皮細(xì)胞I/R 損傷尋找更多的治療 靶點(diǎn)。

綜上所述，普羅布考對(duì)OGD/R 引起的HK-2 損傷具有保護(hù)作用，可能的機(jī)制是通過(guò)激活GPX，尤其是提高GPX4 水平，直接或間接抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的過(guò)度產(chǎn)生。本研究不僅為普羅布考老藥新用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，還為GPX4 作為腎小管上皮細(xì)胞I/R 損傷的治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。