臭氧急性暴露對大鼠血管的損傷及其機(jī)制*

楊 虎， 李 寧， 韓 潔,3， 朱晨麗， 田 蕾， 林本成， 襲著革， 劉曉華,3△， 初 楠△

(1. 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院， 遼寧 大連 116001； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050； 3. 天津體育學(xué)院， 天津 301617)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，空氣污染問題日益突出。除了廣泛關(guān)注的固態(tài)顆粒物(particulate matter，PM)外，臭氧 (O3)越來越成為夏季重要的環(huán)境污染物，臭氧與人群健康的關(guān)系也逐步受到重視，已成為研究的熱點(diǎn)。臭氧是一種強(qiáng)氧化性的氣體，一方面可與直接接觸的人體組織(呼吸道、肺、角膜等)產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化效應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷[1]；另一方面，可通過與肺泡液及肺泡上皮細(xì)胞反應(yīng)生成氧化產(chǎn)物(醛類，羧酸和過氧化氫)，產(chǎn)物隨后進(jìn)入血液循環(huán)，對機(jī)體產(chǎn)生更廣泛的損傷[2]。血管在機(jī)體內(nèi)參與多種生理生化過程，包括物質(zhì)運(yùn)輸、維持調(diào)節(jié)血壓、參與凝血及抗凝反應(yīng)，炎癥反應(yīng)以及內(nèi)分泌功能。血管損傷是動脈粥樣硬化形成、血栓性疾病的重要原因。流行病學(xué)研究已顯示臭氧暴露會增加心血管疾病死亡率。在中國，大氣臭氧濃度每增加10 μg/m3，人群中心血管疾病死亡率增加 0.448% (95% CI 0.171%,0.724%)[3, 4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，短期臭氧暴露導(dǎo)致心血管死亡率增加的可能機(jī)制是血壓升高和血小板活化[5]，或者通過顆粒物來間接介導(dǎo)損傷[6]。而Xie等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射的臭氧可以導(dǎo)致炎癥因子和血管內(nèi)皮生長因子升高，這提示臭氧可以導(dǎo)致炎癥并促進(jìn)血管內(nèi)皮增生。Miller等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，臭氧暴露后可增加胚胎植入后的 Long-Evans大鼠子宮動脈血流阻力增加。Micheal等[9]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臭氧0.8 ppm持續(xù)24 h急性暴露后，SD大鼠離體冠脈血管對乙酰膽堿堿的逆收縮反應(yīng)降低。目前有關(guān)臭氧單因素多濃度急性暴露對血管損傷和機(jī)制的研究尚未見報道，因此，本研究選擇不同濃度臭氧建立大鼠急性暴露模型，觀察其對血管的結(jié)構(gòu)與功能，對血液中多種生化、代謝指標(biāo)，以及氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等的影響，明確臭氧急性暴露對血管的損傷效應(yīng)，并探討可能的作用機(jī)制，為防治臭氧暴露導(dǎo)致的心血管系統(tǒng)損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

氣體染毒柜(HRH CSED-K，北京慧榮和)，臭氧發(fā)生器(FW-120，Vonti，中國)，臭氧監(jiān)測儀(1003 AH，CA，Glendale)，醫(yī)學(xué)生理信號采集系統(tǒng)(PClab-UE，北京微信斯達(dá)科技有限公司)，冷凍離心機(jī)(TGL-20M，湘儀)，連續(xù)可見光譜酶標(biāo)儀(xMark Microplate Spectrophotometer，Bio-Rad)，液相芯片儀(Luminex200，德國Merk公司)，血生化分析儀(C501，羅氏)，血流變分析儀(ZL6000，眾馳偉業(yè))；Wistar大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，大鼠內(nèi)皮素1(endothelin-1, ET-1)、血管性血友病因子(von willebrand factor, vWF)、同型半胱氨酸(hemocysteine, HCY)、白介素6(interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)檢測試劑盒酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(北京博奧拓達(dá))，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮(nitric oxide, NO)檢測試劑盒(南京建成生物科技公司)。10%甲醛固定液、無水乙醇、二甲苯和蘇木素-伊紅(HE)染液(Solarbio公司)。

1.2 動物分組與處理

健康雄性Wistar大鼠120只，體重175～200 g，隨機(jī)分為6組，每組20只，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(21±1)℃，濕度50%±5%，12 h的光照/黑夜循環(huán)。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，將大鼠放入氣體染毒柜中，對照組暴露于過濾后空氣，處理組分別暴露于濃度為0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm和4.0 ppm的臭氧，持續(xù)4 h。暴露期間氣體染毒柜中的溫度保持在22.6～25.6℃，濕度保持在35%～65%。暴露結(jié)束后，每組取10只大鼠，稱重后，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待夾趾反射消失后，行右側(cè)頸總動脈插管術(shù)，壓力導(dǎo)管經(jīng)肝素鈉抗凝，通過PC-lab醫(yī)學(xué)生理信號采集系統(tǒng)采集血壓信號，測量頸動脈血壓變化曲線數(shù)據(jù)。剩余10只經(jīng)麻醉后，腹主動脈取血，留取血液樣本。隨后，剪取5只大鼠胸主動脈組織置于10%甲醛固定液固定，用于制備大鼠主動脈石蠟切片。

1.3 血液生化指標(biāo)檢測

大鼠麻醉后腹主動脈取血，用5 ml肝素抗凝管和5 ml含分離膠的促凝管分別采集全血和血清。全血及部分血清樣本送天津迪安診斷實(shí)驗(yàn)室檢測血流變和血液生化指標(biāo)，另一部分血清分裝后于-80℃冰箱凍存，用于其他指標(biāo)檢測。

1.4 血管功能損傷指標(biāo)檢測

通過檢測血清中ET-1、HCY、vWF和NO含量評價血管損傷。血清中ET-1、HCY和vWF含量依照試劑盒說明書，采用ELISA微孔板法檢測。血清中NO含量依照試劑盒說明書，采用微孔板比色法檢測。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

通過檢測血清中SOD、MDA、GSH和8-OHdG含量來評價大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD和MDA分別采用黃嘌呤氧化酶法和TBA法測定，GSH采用微孔板比色法，8-OHdG采用ELISA微孔板法檢測。測試過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測

通過檢測大鼠血清炎癥因子(TNF-α、IL-6)含量來評價大鼠的免疫反應(yīng)，血清中TNF-α和IL-6含量依照試劑盒說明書，采用ELISA微孔板法檢測。

1.7 大鼠主動脈病理變化

取甲醛固定后的胸主動脈組織中段，經(jīng)梯度乙醇逐級脫水15 min，再經(jīng)二甲苯逐級10 min透明，I級蠟10 min、Ⅱ級蠟30 min Ⅲ級蠟45 min逐級浸蠟、石蠟包埋后切片，片厚5 μm，置37℃烤箱中烤片，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇5 min逐級復(fù)水，后進(jìn)行HE(蘇木素-伊紅)染色，再經(jīng)脫水、透明后，用中性樹膠封片，分別取每組5只大鼠胸主動脈組織光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臭氧急性暴露對大鼠頸動脈血壓的影響

結(jié)果表明，臭氧暴露后0.12 ppm與對照組相比動脈最大收縮壓顯著升高(P<0.05)，但隨著暴露濃度繼續(xù)增加逐漸呈降低的趨勢。平均血壓和最大動脈收縮壓趨勢一致，但變化無統(tǒng)計差異，平均舒張壓脈壓隨暴露濃度的增大呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而收縮和舒張間期變化趨勢類似，呈現(xiàn)低濃度升高，高濃度降低的趨勢，盡管與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但反應(yīng)出臭氧急性暴露可導(dǎo)致心率增快(表1)。

2.2 臭氧急性暴露與血液流變學(xué)的改變

結(jié)果表明，臭氧暴露后， 2.0 ppm組與對照組相比全血粘度1/S顯著升高(P<0.05)，各暴露組血漿粘度均顯著升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P< 0.01，P<0.01)，1.0 ppm組與對照組相比血沉方程K值顯著升高(P<0.05)，全血高切還原粘度和相對指數(shù)變化趨勢類似，臭氧濃度0.5 ppm組和4.0 ppm組與對照組相比顯著降低(P<0.05，P<0.01，表2)。

2.3 臭氧急性暴露對血液生化指標(biāo)的影響

結(jié)果表明，總膽固醇在臭氧暴露后下降，臭氧濃度為0.12 ppm，0.5 ppm，1.0 ppm，4.0 ppm組與對照組相比總膽固醇均顯著下降(P<0.01，P<0.05，P<0.05，P<0.05)；高密度脂蛋白膽固醇下降趨勢幅度和總膽固醇相似， 其中0.12 ppm組與對照組相比顯著下降(P<0.01)。非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)有下降趨勢。急性臭氧暴露后血糖(GLU)、電解質(zhì)(K+，Na+，Cl-)和血肌酐(CREA)隨暴露濃度的增大變化不顯著(表3)。

2.4 臭氧急性暴露與血清炎性因子水平的變化

臭氧暴露后血清中炎癥因子的結(jié)果表明，暴露濃度為1.0 ppm組和4.0 ppm組與對照組相比TNF-α均顯著升高(P<0.05，P<0.05)。IL-6略下降，但無統(tǒng)計差異(表4)。

2.5 臭氧急性暴露對氧化應(yīng)激的影響

結(jié)果表明，臭氧暴露較高濃度組2.0 ppm和 4.0 ppm與對照組相比血清中GSH時顯著下降(P< 0.05，P<0.01，表5)，而在臭氧濃度1.0 ppm組和2.0 ppm組與對照組相比MDA顯著升高(P< 0.05，P<0.05，表5)。8-OHdG和SOD活力變化無統(tǒng)計學(xué)差異(表5)。

2.6 臭氧急性暴露對血管結(jié)構(gòu)和功能的影響

結(jié)果表明，4.0 ppm組與對照組相比ET-1顯著升高(P<0.05)，而臭氧濃度1.0 ppm組與對照組相比大鼠血清HCY顯著升高(P<0.05)，vWF和一氧化氮變化不顯著。并且，臭氧急性暴露后大鼠血管主動脈石蠟切片經(jīng)HE染色后觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的血管內(nèi)皮及血管壁病理改變(未附圖)。

Tab. 1 Blood pressure changes after acute exposure to ozone in n=10)

*P<0.05vs0 ppm group

Tab. 2 Changes in blood rheology after ozone n=10)

*P<0.05,**P<0.01vs0 ppm group

Tab. 3 Changes of blood lipid l indicators after acute ozone exposure(mmol/L, n=10)

TG: Triglyceride; TC: Total cholesterol; HDL-C: High density lipoprotein cholesterol; LDL-C: Low density lipoprotein cholesterol; non-HDL-C: non-High density lipoprotein cholesterol; CREA: Creatinine

*P<0.05,**P<0.01vs0 ppm group

Tab. 4 Inflammatory factors changes after acute exposure to ozone in rats(pg/ml, n=10)

TNF-α: Tumor necrosis factor alpha level; IL-6: Interleukin -6 level

*P<0.05vs0 ppm group

Tab. 5 Oxidative stress changes after acute exposure to ozone in n=10)

GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde; 8OHdG: 8-hydroxydeoxyguanosine

*P<0.05，**P<0.01vs0 ppm group

Tab. 6 Vascular endothelial injury of rats after acute exposure to ozone in n=10)

ET-1: Endothelin-1; HCY: Homocysteine; NO: Nitric oxide; vWF: von Willebrand factor

*P<0.05vs0 ppm group

3 討論

已有研究提示，臭氧可以通過直接或間接途徑導(dǎo)致機(jī)體的損傷。鑒于血管在循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究系統(tǒng)地探討了臭氧急性暴露對血管的損傷效應(yīng)，以及對相關(guān)因素的影響。

首先，本文檢測了臭氧急性暴露對血管結(jié)構(gòu)和功能的影響。雖然未觀察到血管結(jié)構(gòu)變化，但是血管損傷標(biāo)志ET-1在臭氧暴露后顯著升高。ET-1是血管內(nèi)皮損傷后分泌的一種強(qiáng)效血管收縮劑，對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均能刺激心肌細(xì)胞肥大[10]，引起血管平滑肌產(chǎn)生MCP-1，趨化單核細(xì)胞浸潤[11]。同時較高濃度臭氧暴露后血清中HCY升高，HCY是人體內(nèi)含硫氨基酸的重要中間代謝產(chǎn)物，同型半胱氨酸被認(rèn)為是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素[12]，提示可能影響含硫氨基酸代謝，HCY可以使血管舒縮功能減退[13]，長期暴露可能導(dǎo)致H型高血壓。臭氧暴露后的HCY及ET-1的升高對于那些對心臟后負(fù)荷敏感的心衰和冠心病病人是一個不利因素[14]。

其次本文為了探討不同濃度臭氧急性暴露對血管影響的可能機(jī)制，對與血管相關(guān)的生理、生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測。低濃度臭氧(0.12 ppm)急性暴露可導(dǎo)致動脈收縮壓升高，而此濃度下血清ET-1水平并未顯著升高，動脈收縮和舒張間期在臭氧暴露后隨濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，提示臭氧導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮。這些結(jié)果與Barath[15]等人的研究結(jié)果相一致，即臭氧暴露導(dǎo)致血管對舒血管物質(zhì)反應(yīng)敏感性升高，神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制參與血壓調(diào)節(jié)并起到?jīng)Q定性作用。

血液流變學(xué)及血液生化指標(biāo)結(jié)果顯示，血漿粘度增加，紅細(xì)胞變形指數(shù)也增加，TC及HDL-C降低，且趨勢和幅度一致。這提示臭氧暴露可以導(dǎo)致血流變學(xué)改變，可能與應(yīng)激反應(yīng)、代謝產(chǎn)物增加或者炎癥物質(zhì)釋放激活血小板有關(guān)。低濃度的臭氧暴露即可引起血漿粘度升高，對于動脈粥樣硬化患者特別是冠心病不穩(wěn)定斑塊患者是一個危險因素。HDL-C降低與心血管疾病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)[16, 17]，對心血管疾病為保護(hù)因素，其降低可能臭氧急性暴露損傷引起的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。Tham[18]等進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果提示，臭氧暴露可能與膽固醇代謝障礙相關(guān)，血脂對血管壁的影響較緩慢，所以亞慢性或者慢性臭氧暴露對于HDL-C的影響有待進(jìn)一步研究。

血清中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)狀態(tài)結(jié)果顯示，臭氧暴露后血清中GSH降低，高濃度組降低更顯著，而MDA含量升高，提示臭氧暴露導(dǎo)致機(jī)體抗氧化調(diào)節(jié)的紊亂，可進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。Raghavan[19]的研究表明，MDA可通過誘導(dǎo)炎癥途徑和網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化，MDA的升高是炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的誘因。臭氧暴露后血清中炎癥因子TNF-α顯著升高。TNF-α的釋放增加，可使巨噬細(xì)胞游走活化增強(qiáng)[20]，使炎癥損傷范圍加大和強(qiáng)度加重，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)皮下是動脈粥樣硬化斑塊形成的條件之一，也是不穩(wěn)定斑塊破裂的可能原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度臭氧暴露時炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，但低濃度暴露時改變不明顯。Henriquez等[21]利用腎上腺素能和糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑可減少臭氧誘導(dǎo)的肺損傷和炎癥，這對于我們進(jìn)行下一步探討防治臭氧導(dǎo)致的心血管損傷措施提供了參考。

綜上所述，臭氧急性暴露可影響大鼠的動脈血壓、血流變及膽固醇代謝，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，其損傷的機(jī)制可能與神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂、誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)和系統(tǒng)炎癥有關(guān)。