CaCl2增強橄欖假絲酵母對蘋果果實采后青霉病的生防效力

蔡孟軒，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

果蔬采后生物防治關(guān)鍵在于拮抗微生物能夠在果皮或體內(nèi)定植，通過自身的不斷繁殖從而對病原菌產(chǎn)生對抗作用，而酵母和病原真菌都屬于異養(yǎng)生物，必須從外界吸收營養(yǎng)物質(zhì)來維持生存。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，橄欖假絲酵母（Candida oleophila）可能的抑菌機制為營養(yǎng)和空間的競爭，當(dāng)拮抗菌數(shù)量充足時，拮抗酵母能夠搶占更多的營養(yǎng)物質(zhì)和空間，從而抑制病原菌的生長[1-2]?，F(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)，Pichia caribbica、Pichia guilliermondii、Aureobasidium pullulans等拮抗菌均可以通過營養(yǎng)與空間競爭的作用機制減少果蔬采后真菌病害[3-5]。當(dāng)向酵母添加外源營養(yǎng)物時，營養(yǎng)物的種類、添加量都會對酵母的控制病害效果產(chǎn)生影響。目前有研究表明，拮抗微生物通過結(jié)合某些佐劑即營養(yǎng)物質(zhì)（如某一種糖類、氨基酸等）可以增加其群體數(shù)量并增強其存活率，同時，病原菌對這些佐劑的利用率則較低，在兩種因素共同作用下，控病效果大大提升。除了營養(yǎng)和空間的競爭機制外，誘導(dǎo)果實自身產(chǎn)生抗病性也是拮抗酵母作用的機制之一[6-7]。當(dāng)植物體受到生物、化學(xué)或者物理因素影響時，會刺激其自身抵抗病原菌的相關(guān)防御系統(tǒng)，酵母作為一種生物激發(fā)子，可以誘導(dǎo)植物體自身產(chǎn)生一系列抗性相關(guān)的物質(zhì)[8-9]。拮抗酵母產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗病性可以促進植物組織產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白家族和酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶如過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）的活力，以及促進木質(zhì)素和酚類物質(zhì)的生成等[7,10]。

近幾年的研究結(jié)果表明，CaCl2可以和多種酵母結(jié)合使用，增強拮抗酵母菌對多種果實病害的生防效力。然而，有關(guān)CaCl2和C. oleophila結(jié)合使用控制蘋果果實采后青霉病病害的相關(guān)研究卻鮮見報道。本研究先通過離體實驗考察CaCl2對C. oleophila和擴展青霉菌（Penicillium expansum）生長狀況的影響，在此基礎(chǔ)上進行蘋果果實活體實驗，篩選最佳的復(fù)合比例并探究最佳復(fù)合質(zhì)量濃度CaCl2結(jié)合C. oleophila處理果實，增強C. oleophila對蘋果果實采后青霉病的控制效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅富士’蘋果產(chǎn)自甘肅靜寧，取大小均一、無機械傷、成熟度基本一致的果實作為實驗材料。經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉浸泡2 min后，自來水沖洗，晾干備用[11]。

C. oleophila分離自重慶北碚歇馬鎮(zhèn)馮家槽柑桔樹（‘錦橙447’）葉片表面。該菌株在NYDA培養(yǎng)基（酵母膏5 g、牛肉膏8 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、水1 000 mL）中、4 ℃條件下保藏。每兩個月活化一次。

擴展青霉菌分離自發(fā)病蘋果果實。采用組織分離法從發(fā)病蘋果果實上分離病原菌，且致病性檢測結(jié)果、病原菌菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明其為擴展青霉菌。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；BS-4G振蕩培養(yǎng)箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；XB.K.25血球計數(shù)板型 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SL602N高精顯電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離體條件下CaCl2對C. oleophila和P. expansum生長狀況的影響

1.3.1.1 CaCl2在NYDB培養(yǎng)基中對C. oleophila生長狀況的影響

在含90 mL NYDB液體培養(yǎng)基的試管中分別加入10 mL不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液，使試管中CaCl2的最終質(zhì)量濃度為0、10、20、50、100 g/L。將2 mL 1×108CFU/mL的C. oleophila細(xì)胞懸浮液接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)，在28 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后計數(shù)。每個處理組重復(fù)3 次。

1.3.1.2 CaCl2在PDA培養(yǎng)基中對P. expansum生長狀況的影響

用移液器吸取1 μL 1×106CFU/mL的P. expansum孢子懸浮液點在含有不同質(zhì)量濃度CaCl2（0、5、10、20 g/L）PDA培養(yǎng)基中央。25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后拍照。每個處理組重復(fù)3 次。

1.3.2 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制作用

1.3.2.1 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制效果

將果實隨機分成6 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離打孔（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個處理組果實傷口處分別加入20 μL下述液體：1）無菌水（陽性對照）；2）1×107CFU/mL C. oleophila懸浮液；3）5 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液；4）10 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液；5）20 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. Oleophila混合懸浮液；6）50 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液。4 h后，在果實傷口處接入20 μL的1×105CFU/mL P. expansum孢子懸浮液，待菌液吸收后，單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，定期統(tǒng)計果實發(fā)病率和病斑直徑。每個處理組10 個果實，重復(fù)3 次。

1.3.2.2 CaCl2復(fù)合處理對C. oleophila在蘋果果實傷口生長動態(tài)的影響

傷口接種處理：將果實隨機分成2 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離地打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個傷口處分別加入20 μL的1×107CFU/mL C. oleophila懸浮液、10 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液。待菌液吸收后，單果包裝，在25 ℃、相對濕度90%～95%環(huán)境下貯藏，以接種后1 h測定的酵母菌數(shù)為起始值，每天取一次樣，用稀釋平板法測定酵母數(shù)目。取樣時，用消毒的打孔器取傷口處直徑為1 cm的果肉組織10 份，放入含10 mL無菌水的消毒研缽內(nèi)研磨至勻漿，25 ℃條件下培養(yǎng)48 h后計數(shù)，結(jié)果以每傷口處酵母數(shù)量為單位（lg（cells/wound）），每個處理組重復(fù)3 次，每個重復(fù)10 個果實，實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理誘導(dǎo)蘋果果實抗病性機制

1.3.3.1 樣品處理及取樣方法

將果實隨機分成3 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離地打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個傷口處分別加入20 μL的無菌水（陽性對照）、1×107CFU/mL C. oleophila懸浮液、10 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液。貯藏及取樣方法同1.3.2.2節(jié)，每個處理組重復(fù)3 次，每個重復(fù)30 個果實，實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.2 CHI、GLU活力測定

酶提取液制備：稱取1.0 g蘋果果肉，加入4 mL 200 mmol/L pH 5.2的醋酸緩沖液，在冰浴條件下研磨勻漿，于4 ℃、8 000 r/min離心30 min，收集上清液用于CHI和GLU活力測定。

CHI活力的測定參考Boller等[12]的方法并略作修改。取0.05 mL粗酶液，加入0.5 mL 10 mg/mL膠狀幾丁質(zhì)懸浮液和0.95 mL 100 mmol/L pH 5.2的醋酸緩沖液，混合后在37 ℃保溫培養(yǎng)1 h。然后往該混合液中加入0.1 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的脫鹽蝸牛酶，繼續(xù)37 ℃保溫培養(yǎng)70 min，立即加入0.2 mL 0.6 mol/L的四硼酸鉀溶液，沸水浴3 min，然后迅速冷卻。冷卻完畢，加入2 mL用冰醋酸稀釋5 倍體積的對二甲氨基苯甲醛儲備液。再37 ℃保溫培養(yǎng)30 min顯色，然后測定585 nm波長處的吸光度。以煮沸5 min酶液作對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算N-乙酰葡萄糖胺（Glc-Nac）生成量，以每秒鐘每克蛋白分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol Glc-NAc為一個酶活力單位（U）。實驗重復(fù)3 次。

GLU活力測定參考Abeles等[13]的方法并略作修改。取100 μL粗酶液，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%昆布多糖溶液，于37 ℃保溫反應(yīng)45 min后，加入1.8 mL蒸餾水和1.5 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min終止酶促反應(yīng)。煮沸后迅速冷卻，然后用蒸餾水將顯色的反應(yīng)液稀釋至25 mL，混勻，測定540 nm波長處的吸光度。以加熱煮沸5 min的酶液作對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算生成還原糖的量，以每秒鐘每毫克蛋白分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol葡萄糖為一個酶活力單位（U）。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3.3 木質(zhì)素含量的測定

木質(zhì)素含量的測定參照Li Hua等[14]的方法并略作修改。稱取1 g樣品，加5 mL、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液研磨，經(jīng)8 000 r/min離心10 min，沉淀物以3 mL 95%乙醇溶液沖洗3 次，再用3 mL乙醇-正己烷（1∶2，V/V）離心沖洗3 次，收集沉淀物，于65 ℃環(huán)境下干燥12 h左右。干燥物溶于3 mL、體積分?jǐn)?shù)25%溴乙酰冰醋酸溶液中，在70 ℃恒溫水浴中加塞保溫30 min，然后加0.9 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，再以冰醋酸定容至10 mL，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液0.50 mL加入到9.50 mL蒸餾水中，以蒸餾水為參比調(diào)零，在280 nm波長處測定光密度。以每克鮮質(zhì)量樣品在280 nm處的光密度（OD值）表示木質(zhì)素含量。重復(fù)3 次。

1.3.3.4 總酚和類黃酮含量的測定

總酚和類黃酮含量測定參照Deng Lili等[15]的方法進行測定。1.0 g樣品與預(yù)冷的20 mL、體積分?jǐn)?shù)1%HCl-甲醇溶液充分研磨提取，然后4 ℃、12 000×g離心10 min，上清液直接用于比色。總酚含量以每克鮮質(zhì)量樣品在280 nm波長處的光密度（OD值）表示，類黃酮含量以每克鮮質(zhì)量樣品在325 nm波長處的光密度（OD值）表示。實驗重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2016軟件統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)差并制圖；應(yīng)用SPSS 22軟件進行方差分析，利用鄧肯氏多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下CaCl2對C. oleophila和P. expansum生長狀況的影響

2.1.1 CaCl2在NYDB培養(yǎng)基中對C. oleophila生長狀況的影響

CaCl2在NYDB培養(yǎng)基中對C. oleophila生長狀況的影響如圖1所示，在28 ℃下培養(yǎng)24 h后，當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度小于50 g/L時，CaCl2對C. oleophila生長有顯著促進作用（P＜0.05）；100 g/L CaCl2對C. oleophila生長有顯著抑制作用（P＜0.05）。說明不同質(zhì)量濃度的CaCl2對C. oleophila的生長狀況有不同影響。

圖1 不同CaCl2質(zhì)量濃度對C. oleophila生長情況的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of CaCl2 on the growth of C. oleophila

2.1.2 CaCl2在PDA培養(yǎng)基中對P. expansum生長狀況的影響

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CaCl2對P. expansum生長狀況的影響Fig. 2 Inhibitory effects of different concentrations of calcium chloride on mycelial growth of P. expansum

CaCl2在PDA培養(yǎng)基中對P. expansum生長狀況的影響如圖2所示，在25 ℃下培養(yǎng)7 d后，與對照組（0 g/L）相比，5 g/L CaCl2處理對P. expansum生長有促進作用，其P. expansum產(chǎn)孢能力較強。與對照組相比，10、20 g/L CaCl2處理對P. expansum生長有抑制作用，其P. expansum產(chǎn)孢能力弱。說明不同質(zhì)量濃度的CaCl2對P. expansum的生長狀況有不同影響。

2.2 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制作用

2.2.1 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制效果

CaCl2與C. oleophila復(fù)合使用對蘋果果實采后青霉病的抑制效果如圖3所示，在貯藏3 d和4 d時，5 個處理組果實的發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對照果實（P＜0.05），說明這5 種處理均能有效延緩蘋果果實采后青霉病的發(fā)生。在整個貯藏期間，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實的發(fā)病率和病斑直徑顯著低于其他5 組（P＜0.05），說明其控制病害的效果最好。以該條件處理果實，進行復(fù)合處理誘導(dǎo)果實抗病性機制的研究。

圖3 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實采后青霉病的控制效果Fig. 3 Effects of calcium chloride combined C. oleophila on disease incidence and lesion diameter in apples inoculated with P. expansum

2.2.2 CaCl2對C. oleophila在蘋果果實傷口生長動態(tài)的影響

圖4 CaCl2對C. oleophila在蘋果果實傷口生長動態(tài)的影響Fig. 4 Effect of calcium chloride on the growth dynamics of C. oleophila on apples

如圖4所示，2 個處理組C. oleophila均能在果實傷口處迅速定植、擴增，10 g/L CaCl2處理對C. oleophila在蘋果果實傷口處的生長具有促進作用，貯藏2 d時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組的C. oleophila的數(shù)量比接種時增加了1.91（lg（cells/wound））。

2.3 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理誘導(dǎo)蘋果果實抗病性機制

2.3.1 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實CHI和GLU活力的影響

圖5 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig. 5 Effect of calcium chloride with C. oleophila treatment on CHI (A)and GLU (B) activities in apples

CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實CHI活力的影響如圖5A所示。在5 d的貯藏期內(nèi)，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組和C. oleophila單獨處理組蘋果果實的CHI活力大致呈先上升后下降的趨勢。第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實的CHI活力顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05）。

CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實GLU活力的影響如圖5B所示，在5 d的貯藏期內(nèi)，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實的GLU活力總體呈先上升后下降的趨勢，且與對照組差異顯著（P＜0.05）。貯藏第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實的GLU活力約為對照組的2.2 倍。

2.3.2 CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的影響

CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實總酚含量的影響如圖6A所示。在5 d的貯藏期內(nèi)，所有組蘋果果實的總酚含量總體呈先上升后下降的趨勢；C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實總酚含量顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05）。貯藏第3天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實總酚含量達(dá)到最高，約為C. oleophila處理組的1.36 倍。

CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實類黃酮含量的影響如圖6B所示。在5 d的貯藏期內(nèi)，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實類黃酮含量顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05）。在貯藏第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實類黃酮含量達(dá)到最大，約為C. oleophila組的1.11 倍。

CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對蘋果果實木質(zhì)素含量影響如圖6C所示。在5 d的貯藏期內(nèi)，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實木質(zhì)素含量顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05），貯藏第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實木質(zhì)素含量達(dá)到最高。

圖6 CaCl2與C. oleophila處理對蘋果果實總酚（A）、類黃酮（B）和木質(zhì)素（C）含量的影響Fig. 6 Effect of calcium chloride with C. oleophila treatment on the contents of total phenols (A), flavonoids (B) and lignins (C) in apples

3 討 論

前期研究表明，C. oleophila具備很高的商業(yè)化應(yīng)用價值，但是，單一地使用拮抗酵母對果蔬采后進行生物防治的效果并不比傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑好，故而積極探索如何提高酵母的生防效力便顯得尤為重要。目前，有多項研究將拮抗酵母復(fù)合其他物質(zhì)（如金屬離子、有機物、化學(xué)殺菌劑和其他化學(xué)或天然物質(zhì)）以達(dá)到增效目的[19-24]。外源物質(zhì)通過提高拮抗微生物在果實表面的生長數(shù)量，不僅可以有效地對抗病原菌的侵害，還可降低拮抗菌劑的用量，是一種更為安全有效的方式，具有很好的應(yīng)用前景。

相關(guān)研究表明，果蔬在采后經(jīng)過一定的物理或化學(xué)因子處理后，可產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，從而減少其采后病害的發(fā)生率[25-28]。CaCl2是果蔬采后處理的傳統(tǒng)方法之一，能夠?qū)卟珊筚A藏期有明顯的延長作用[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，C. oleophila與10 g/L CaCl2復(fù)合處理對蘋果果實采后青霉病的發(fā)生抑制效果最好，10 g/L CaCl2對C. oleophila控制蘋果果實采后青霉病的發(fā)生具有增效作用。

為進一步探討CaCl2與C. oleophila復(fù)合處理對P. expansum的抑制機理，本實驗測定了C. oleophila與10 g/L CaCl2復(fù)合處理對蘋果相關(guān)防御酶及物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，該復(fù)合處理能有效誘導(dǎo)蘋果相關(guān)抗性酶活力的提高。本實驗選取與果蔬采后病程相關(guān)的酶及代謝產(chǎn)物，探究其與果蔬采后病害防治關(guān)系。病程相關(guān)蛋白家族和酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶與植物體內(nèi)抵抗病原微生物的侵染都有著一定的關(guān)系。酚類物質(zhì)具有直接的抗菌作用[32]，病原真菌的細(xì)胞壁主要成分為幾丁質(zhì)和葡聚糖，CHI和GLU均可通過水解病原菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)和葡聚糖，使得病原菌原生質(zhì)膜破裂從而殺死病原菌[33]。CHI和GLU在降解病原菌細(xì)胞壁時會產(chǎn)生協(xié)同作用，從而使抑菌活性達(dá)到最大[34]。本研究結(jié)果表明，C. oleophila與10 g/L CaCl2復(fù)合處理能顯著提高蘋果的CHI、GLU活力和總酚、木質(zhì)素、類黃酮含量。因此，該復(fù)合處理可以通過提高防御酶活性、抗病相關(guān)蛋白活性，增加抗病物質(zhì)的含量，從而誘導(dǎo)蘋果果實采后抗病性的產(chǎn)生。