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    馬鈴薯糖蛋白Patatin的研究進展

    2019-07-01 07:50:50劉垚彤董墨思冀迎昕李拖平李蘇紅
    食品科學 2019年11期
    關鍵詞:腎素馬鈴薯凝膠

    劉垚彤,孫 偉,董墨思,冀迎昕,李拖平,李蘇紅*

    (沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧 沈陽 110866)

    馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是茄科茄屬多年生塊莖草本植物,營養(yǎng)豐富,素有“地下蘋果”和“第二面包”之稱,是位居小麥、水稻、玉米之后的第四大糧食作物[1]。馬鈴薯蛋白質由19 種氨基酸組成[2],其中必需氨基酸含量為20.1%,占總氨基酸的47.9%,與雞蛋蛋白必需氨基酸/總氨基酸(49.7%)相當,比聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織已確定的標準蛋白(36.0%)要高,且致敏蛋白含量較少[3],賴氨酸比例高。馬鈴薯蛋白質按分子質量大小分為高分子質量蛋白質、Patatin(馬鈴薯糖蛋白)和蛋白酶抑制劑3 部分[4-9]。Patatin為主要的貯藏蛋白,已被證明具有優(yōu)異的起泡性、乳化能力、抗氧化能力和酯?;饷福╨ipid acyl hydrolase,LAH)活性[10-13],可以用作食品加工領域具有高功能價值的食品配料及輔料。

    在我國,馬鈴薯主要用于生產(chǎn)淀粉,這一過程中產(chǎn)生的大量廢液稱為馬鈴薯汁。據(jù)統(tǒng)計,1 000 kg馬鈴薯生產(chǎn)淀粉的過程可以產(chǎn)生5~12 m3的廢液,其中含有質量分數(shù)1%~2%的蛋白質[14]。同時廢液中含有蛋白質、肽、氨基酸和胺類物質,這會造成工業(yè)上處理廢液的成本高昂[15]。若將馬鈴薯汁直接排放,不僅造成蛋白資源的大量浪費,還造成環(huán)境污染。目前,環(huán)境改善是全球關注的重點之一,同時植物性蛋白質資源在世界蛋白質資源中也占有重要的地位。所以,如何更有效地利用工業(yè)淀粉廢液提取Patatin并全方位開發(fā)其功能性,以及在食品領域的更多應用性將成為今后的研究熱點。

    本文介紹了Patatin的分子質量、結構特性、物化特性及功能特性,綜述了國內(nèi)外關于Patatin的提取、分離純化方法,及在食品領域的應用研究,為馬鈴薯蛋白資源的進一步開發(fā)應用提供參考。

    1 Patatin的分子質量及結構特性

    圖1 馬鈴薯蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis pattern of total proteins in potato tubers

    圖1 為馬鈴薯蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis,SDS-PAGE)圖。Patatin分子質量為39~45 kDa,是馬鈴薯蛋白質中的酸性蛋白組分,占總蛋白質量的30%~40%左右。蛋白酶抑制劑的分子質量為5~25 kDa,屬于馬鈴薯蛋白質中堿性蛋白組分,占總蛋白質量的50%左右。高分子質量蛋白組分則占總蛋白質量的10%左右,目前有關其功能性質的研究報道較少。

    Patatin是糖和蛋白的復合物,含有32%的糖和64%的蛋白質,孫瑩等[16]通過氣相色譜得到分子質量為40.6 kDa的馬鈴薯糖蛋白Patatin,并與標準混合單糖氣相色譜進行對比,確定其單糖組成為:鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(圖2),這些單糖組成可能與其生理活性相關。Tsukagoshi等[17]發(fā)現(xiàn)云芝中的多糖Krestin(polysaccharride-K,PSK)具有抗腫瘤活性,推測是其結構中的葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖發(fā)揮了作用。目前馬鈴薯濃縮蛋白的抗腫瘤作用已得到證實[18],Patatin結構與生理活性的構效關系還有待進一步深入研究。此外,Patatin中含有吡喃型α-糖苷鍵,β-消去反應前后經(jīng)紫外光譜測定表明,糖鏈的存在提高了Patatin的抗變性能力。同時甘露糖的存在使Patatin對甘露糖有高度的親和力,可以吸附到ConA-瓊脂糖凝膠介質上進行親和純化。

    圖2 標準混合單糖(A)和Patatin(B)氣相色譜圖[16]Fig. 2 Gas chromatograms of mixed monosaccharide standards (A)and patatin (B)[16]

    Patatin是由兩個多基因組(Class I和Class II)表達的,兩個多基因組的同源度可達98%。其中,Class I基因組主要在馬鈴薯塊莖中表達且表達量大,Class II在整個植物體系都有表達但表達量較小[19-21]。Patatin在自然狀態(tài)下常以二聚體形式存在,不同品種或相同品種的馬鈴薯中都存在異型體,由于基因的高度同源性,這些異構體之間的結構特性和熱穩(wěn)定性沒有顯著差異,在pH 6~8的范圍內(nèi),Patatin的構象最穩(wěn)定[22-23]。Patatin的一級結構由362 個氨基酸殘基組成,一般不受外界環(huán)境因素的影響[24-26]。而二、三級結構容易受外界環(huán)境因素的影響,但pH值引起Patatin的側鏈氨基酸殘基微環(huán)境的變化是可逆的。在pH 4、5條件下,Patatin的二級結構均以α-螺旋和β-折疊為主;pH 6~9條件下,Patatin的二級結構均以β-折疊為主;在溫度低于40 ℃時,Patatin結構與溫度變化的相關性不明顯;隨著溫度升高,α-螺旋含量迅速下降,無規(guī)卷曲含量迅速增加,當溫度達到80 ℃時,無規(guī)卷曲占主導地位,α-螺旋含量仍然保持在25%以上,說明Patatin是一種高熱穩(wěn)定性蛋白;而尿素、DDT等變性劑會對Patatin二級結構造成巨大破壞,使其結構由有序變成無序[27]。

    2 Patatin物化性質及功能特性

    Patatin具有較好的溶解性、乳化性、起泡性及凝膠性,還具有抗氧化活性、LAH活性,LAH具有催化磷脂、糖脂、單/二?;视鸵约伴L鏈脂肪酸酯的非特異性水解活性。Patatin的必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index,EAAI)為89%,比許多動植物蛋白的EAAI高[28]。

    2.1 溶解度

    Patatin溶解度受溫度、pH值、鹽離子種類及強度、有機溶劑種類及強度等因素的影響。在溫和的酸性條件下,離子強度和未折疊的Patatin影響馬鈴薯總蛋白的溶解度[29-30]。Patatin在pH值小于3和大于6的條件下溶解度為100%,在等電點附近(4.0~5.2)溶解度最小,而蛋白酶抑制劑則在整個pH值范圍內(nèi)均是可溶的。相同pH值條件下,添加FeCl3會增加溶解度;添加乙醇,則溶解度隨pH值和熱處理溫度的變化而發(fā)生微小變化。利用Patatin和蛋白酶抑制劑溶解性的差異,可實現(xiàn)兩者從馬鈴薯淀粉廢液中的初步分離,為后續(xù)Patatin的大量純化制備提供了可能。

    2.2 凝膠性

    Patatin在加熱過程中形成凝膠主要經(jīng)過兩個階段,第1階段是初始的球狀蛋白結構部分變性,第2階段是蛋白分子之間的聚合[31]。因為球蛋白本身變性不足以引起凝膠化,需要分子間相互結合形成一個連續(xù)的網(wǎng)絡結構,進而促進聚集和凝膠化;因此,第2階段在Patatin凝膠過程中起主要作用。Patatin凝膠性也受到pH值、溫度、離子強度和加熱時間等因素的影響。Pots等[32]發(fā)現(xiàn)Patatin在等電點附近時,無論是否存在NaCl,Patatin的熱聚合敏感性都較高,而遠離等電點且無NaCl存在時,則難以發(fā)生熱聚合。與馬鈴薯分離蛋白的凝膠條件(蛋白質量濃度高于6 g/100 mL、pH 7.0、加熱溫度90 ℃、加熱時間30 min)相比,Patatin凝膠所需的溫度更低(蛋白質量濃度高于6 g/100 mL、pH 7.0、加熱溫度69 ℃、加熱時間30 min),更容易形成凝膠。而與β-乳球蛋白、卵清蛋白和大豆蛋白相比,Patatin凝膠形成所需的離子強度更低[33-34]。因此,Patatin具有良好的凝膠性,可作為一種新型的凝膠蛋白應用于食品中。

    2.3 乳化性和起泡性

    馬鈴薯蛋白具有較好的乳化性和起泡性。常溫下,蛋白酶抑制劑的乳化特性顯著優(yōu)于Patatin,但是加熱處理后,Patatin卻具有更好的乳化穩(wěn)定性[29]。Patatin的乳化性隨pH值和離子強度的變化而變化。Ralet等[35]研究發(fā)現(xiàn),Patatin在等電點附近且無NaCl存在時可以獲得最好的乳化性,發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于卵清蛋白粉;在任意的pH值和離子強度下,加熱處理Patatin乳狀液都有助于其形成更穩(wěn)定的體系。van Koningsveld等[12]通過攪打實驗和鼓泡實驗發(fā)現(xiàn),在未改性馬鈴薯蛋白中,Patatin的起泡性較差,但泡沫穩(wěn)定性較好。

    2.4 抗氧化活性

    Patatin有12 種可溶的、暴露的且具有自由基清除能力的氨基酸,如甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和組氨酸[36]。Liu等[8]對Patatin進行了體外抗氧化活性實驗,發(fā)現(xiàn)Patatin具有較高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力、抗低密度脂蛋白過氧化反應能力及保護DNA免受羥自由基損傷活性;Sun Ying等[37]研究發(fā)現(xiàn)Patatin也是一種能有效抑制小鼠黑素瘤B16細胞增殖的抗增殖劑。因此,Patatin可能是一種極具潛力的癌癥預防蛋白源和食品功能因子。

    2.5 酶活性

    Patatin具有LAH活性[28,38-39]。提取方式會對Patatin的LAH活性產(chǎn)生影響。凝膠色譜與離子交換色譜相結合分離出的Patatin具有LAH活性[40];酸沉淀法和(NH4)2SO4沉淀法所得分離蛋白對O-硝基苯丁酸酯和4-硝基苯月桂酸酯都具有較高的水解活性;熱酸結合法所得的蛋白水解酶活性較低;羧甲基纖維素鈉絡合法和FeCl3沉淀法所得蛋白則對4-硝基苯月桂酸的水解活性遠高于O-硝基苯丁酸酯[22];Depol 670L(DEP)多酶系統(tǒng)提取的Patatin蛋白提取物具有較高的LAH活性[41]。膨化床法分離所得4 種蛋白組分,其中只含有蛋白酶抑制劑的組分LAH活性幾乎為零,而同時含有Patatin和蛋白酶抑制劑的組分都表現(xiàn)出LAH活性[42]。說明色譜法、酸沉淀法、(NH4)2SO4沉淀法、酶法以及膨化床可以較好地保留Patatin的LAH活性。目前揭示Patatin的LAH活性機理及影響因素的研究較少,進一步的研究將促進Patatin作為新型天然酶制劑在食品領域的應用和發(fā)展。

    3 蛋白提取、分離與純化

    3.1 馬鈴薯粗蛋白的提取方法

    目前,已有許多從馬鈴薯廢液中提取蛋白質的物理及化學方法。如Na2SO4溶液浸提法,雖然得率不高但是操作簡單,且得到的蛋白質無毒,可用于食品加工;熱聚合和酸沉淀法是工業(yè)上常用的方法,操作簡單、成本低,由于會造成蛋白功能活性喪失,所以不適用于食品加工;膜回收法自動化程度高、穩(wěn)定性好但成本高;等電點法、鹽析法超濾法、酶法、膨化床吸附層析法及新型分離提取技術磁性殼聚糖微球法也都各具優(yōu)缺點,具體見表1。

    表1 Patatin的提取方法Table 1 Comparison of extraction methods for patatin

    3.2 Patatin的分離與純化

    表2 Patatin的純化方法Table 2 Comparison of purification methods for patatin

    馬鈴薯蛋白中Patatin的進一步分離純化常采用凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜與離子交換色譜相結合的方法、反相色譜法及基因表達法等,不同方法各具優(yōu)缺點(表2)。但是目前的方法提取量小、成本高,有一定的局限性,研究和完善Patatin用于大規(guī)模提取和工業(yè)化生產(chǎn)的純化方法,將會成為今后研究的熱點。

    4 Patatin在食品中的應用研究

    4.1 作為保護性納米載體材料

    David等[57]發(fā)現(xiàn)以Patatin為主要成分的馬鈴薯分離蛋白與VD結合形成的聚集體要比單獨的VD顆粒尺寸小得多,溶液透明度也更好,且二者形成的納米復合體可以減少巴氏滅菌過程和不同貯藏條件下的VD損失。因此,馬鈴薯蛋白有望成為VD或其他疏水性食品功能因子的良好保護性載體,用于澄清飲料或其他食品生產(chǎn)中,以促進人類健康。關于純化后單一蛋白與VD是否還可形成聚集體,以及Patatin的相對含量對復合體的形成是否有影響,都有待深入研究。

    4.2 作為紅葡萄酒澄清劑

    在葡萄酒釀造過程中,通常使用幾種動物蛋白來調(diào)節(jié)其最重要的感官特征——澀味。澀味主要是唾液蛋白與多酚類物質作用產(chǎn)生沉淀造成的。而用于澄清的蛋白質是通過類似于唾液與多酚反應的機制與葡萄酒中的單寧作用達到目的。Gambuti等[58]比較了Patatin、酪蛋白酸鉀、明膠和卵蛋白作為澄清劑的效果,發(fā)現(xiàn)相同濃度下用Patatin處理后的紅酒中總酚、單寧含量和澀味減少得更多,色度特征沒有損耗,但Patatin在葡萄酒的低pH值條件下溶解度很低;所以Patatin不僅可去除澀味,同時也易被分離去除,不會造成潛在的不穩(wěn)定性。動物蛋白在易感人群中具有潛在的致敏性,Patatin作為植物來源的蛋白引起了越來越多的關注,可作為一種非致敏性蛋白替代動物蛋白。

    4.3 作為生物活性肽調(diào)節(jié)血壓和體液平衡

    血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和腎素是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的兩個關鍵調(diào)節(jié)因子,在血壓和體液平衡中起著重要的生理作用。腎素通過裂解血管緊張肽原,產(chǎn)生血管緊張素-I,再通過ACE轉化成血管緊張素-II(一種維持正常血壓的有效血管收縮劑),由于血管緊張素-I轉化為血管緊張素-II不依賴于ACE,造成了某些抗高血壓藥物治療效果并不理想。

    Fu Yu等[59]通過In Silico Analysis軟件模擬了馬鈴薯Patatin的兩個衍生肽Trp-Gly(WG)和Pro-Arg-Tyr(PRY)對ACE和腎素活性的抑制作用。WG和PRY的ACE半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為231.22、97.59 mol/L;與已知的從大麻籽、油菜、豌豆蛋白和微藻中鑒定出幾種腎素抑制肽相比,Patatin的IC50接近大麻籽(54~93 mol/L),遠高于豌豆肽(9.20~22.66 mmol/L)和菜籽肽(0.968~3.061 mmol/L)。根據(jù)酶抑制動力學,推測出WG和PRY對ACE抑制作用分別為非競爭性和競爭性模式,而對腎素的抑制作用都為混合型;利用固有發(fā)射熒光光譜法,發(fā)現(xiàn)與WG相比,PRY表現(xiàn)出對ACE和腎素分子更強的親和力,被確定為更有效的ACE和腎素抑制劑。目前與使用的各種酶抑制劑相比,Patatin的衍生肽能同時抑制腎素和ACE活性,有望成為新型的高血壓治療藥物或添加劑。

    4.4 水解短鏈脂肪酸的三酰基甘油酯

    成熟奶酪風味的形成是一系列復雜的生化反應的結果,主要來自于成熟過程中酶和微生物作用產(chǎn)生的化合物。奶酪中脂肪分解酶主要來源于牛奶、酸性乳酸菌、霉菌和酵母、凝乳糊的脂肪酶和外源脂肪酶[60-62],外源性脂肪酶在乳品工業(yè)中使用不僅能增加乳酪味道,而且還加速乳酪成熟,但成本較高。Spelbrink等[63]研究了Patatin在奶酪成熟中應用的可能性,分別測定了Patatin對三酰甘油底物鏈長度為C2、C4、C6、C8、C12的水解活性,發(fā)現(xiàn)當?shù)孜镦滈L為C6時活性最強,C4、C8、C2次之,而對C12幾乎沒有水解活性,說明Patatin可以水解水溶性強、疏水性小的甘油三酯;Patatin添加到奶酪中,會釋放適量的游離脂肪酸來提高風味物質的含量,而不會過度分解脂肪和發(fā)生酸?。桓鶕?jù)Arrhenius動力學,發(fā)現(xiàn)Patatin在中等溫度下的水溶液和乳清蛋白溶液中均失活。另外,通過巴氏殺菌法可以使Patatin失活,且副反應較少,所以Patatin有望作為新的外源性脂肪酶添加到奶酪制作中改善風味,或在乳品工業(yè)中使用,同時可以將馬鈴薯淀粉廢液大規(guī)?;厥绽?,減少資源浪費,保護環(huán)境。

    5 結 語

    我國有豐富的馬鈴薯蛋白資源,是重要的工業(yè)和食品原料。Patatin具有良好的溶解性、凝膠性、乳化性和抗氧化性等,在功能性食品、保健性食品和藥品等方面都有廣闊的應用前景。Patatin功能性的深入研究及應用領域的進一步拓展,不僅可以使馬鈴薯蛋白資源得到充分的利用,同時能夠減少環(huán)境污染,提高經(jīng)濟效益。進一步提高Patatin提取純度、保持蛋白的活性及功能穩(wěn)定性,以最節(jié)約的成本和最簡單的方法將Patatin的分離純化落實到工業(yè)化生產(chǎn)是Patatin產(chǎn)品研究開發(fā)的基礎。隨著我國馬鈴薯主食化產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,Patatin的營養(yǎng)功能及其在食品領域的應用研究將日益得到關注和重視。因此,優(yōu)化Patatin的分離純化方法,探索其在食品加工過程中的變化規(guī)律,開發(fā)以Patatin為原輔料的保健食品和藥品將成為今后的研究熱點。

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