siRNA干擾TWSG1表達(dá)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響*

吳佳艷,袁靜怡,曾嘉麗,劉 玥,3△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510515；2.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京 210000；3.廣東省單細(xì)胞技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510515)

日前，扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1(twisted gastrulation protein homolog1，TWSG1)與骨骼、腎臟、膽管等相關(guān)癌癥密切相關(guān)[4-5]?，F(xiàn)有研究表明，TWSG1基因直接影響到骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)以及相關(guān)信號(hào)通路。TWSG1基因沉默對(duì)生物(斑馬魚)的發(fā)育有顯著影響，TWSG1基因的激活或者沉默在不同器官中可能有不同的效應(yīng)[4]。但目前對(duì)TWSG1在胃癌中的研究甚少。RNA干擾(RNA interference，RNAi)指由RNA誘發(fā)基因沉默[6]。RNA干擾技術(shù)因其高特異性、高效性、長(zhǎng)效性，在腫瘤的臨床治療中的應(yīng)用越來越多[7]。本研究使用siRNA干擾人胃癌細(xì)胞SGC-7901中的TWSG1基因，觀察其對(duì)SGC-7901細(xì)胞株增殖與凋亡的影響，為探尋新的有效治療胃癌的方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由南方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，于DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(內(nèi)含10%的胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素)。所有細(xì)胞均置于37 ℃，含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液情況視細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況而定，待細(xì)胞達(dá)到合適的密度，用胰酶消化傳代。

1.1.2儀器 離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)； Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Nano Drop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo公司)；小型水平電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Mini-Protean Tetra電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；Eclipse Ti-s熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；7500Real-Time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；Biorad MJ Mini 梯度PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱(中國(guó)力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.1.3藥品與試劑 SGC-7901細(xì)胞(南方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，pLVX-shRNA1質(zhì)粒(本室保存)，DEME培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶、鏈霉素和青霉素(美國(guó)Gibico公司)，嘌呤霉素(美國(guó)Sigma公司)，Lipofectamine 2000、Trizol(Invitrogen公司)，Prime Script RT reagent Kit 、SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit(Takara公司)，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，PVDF膜(Millipore公司)，TWSG1兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京天德悅公司)，ECL發(fā)光液(美國(guó)Thermo Scientific Pierce公司)，CCK8(日本Dojindo公司)，Annexin V-FITC和PI(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，引物和siRNA(上海生工生物股份有限公司合成)。

1.2方法

1.2.1siRNA干擾TWSG1表達(dá)后篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株 使用siDirect針對(duì)TWSG1基因設(shè)計(jì)siRNA并合成，與載體連接。實(shí)驗(yàn)組分為3組：空白對(duì)照組(SGC-7901細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體,7901-vector)、siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染連接siRNA的載體,7901-siRNA1、7901-siRNA2、7901-siRNA3)。轉(zhuǎn)染篩選后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot分別鑒定mRNA和蛋白，鑒定干擾效果顯著后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)TWSG1 mRNA表達(dá) 采用Trizol提取收集的各組細(xì)胞RNA。采用Prime Script RT reagent Kit制備cDNA，采用RT-PCR以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)TWSG1 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3Western blot檢測(cè)TWSG1蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后，RIPA裂解液提取蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用10%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。低溫下用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，免疫印跡后進(jìn)行曝光，利用凝膠成像系統(tǒng)采集并分析圖像。

比如，有些詞語(yǔ)，從表面解釋較為理性，這時(shí)，教師應(yīng)引導(dǎo)學(xué)生用感性的方式去突破這種客觀限制，正所謂“條條大路通羅馬”。如人教版第十冊(cè)《我的伯父魯迅先生》中，在救助車夫這個(gè)片段中，有個(gè)詞——“飽經(jīng)風(fēng)霜”，如果只是照搬詞典的意思，顯然理解起來是蒼白的。如果能讓學(xué)生走進(jìn)生活去理解這個(gè)詞，說說生活中，你看過的飽經(jīng)風(fēng)霜的臉，顯然這樣更能幫助學(xué)生走進(jìn)文本，去感受車夫遭受的困境。通過這種的學(xué)習(xí)方式，“飽經(jīng)風(fēng)霜”這個(gè)詞在情感上體會(huì)得更加深刻，深入到學(xué)生們的精神世界中。

1.2.4CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 在96孔板按照1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種SGC-7901細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA干擾組各3孔。分別于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h以及72 h時(shí)，加入CCK8檢測(cè)試劑。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定450 nm吸光度(OD值)值。繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5AnnexinV-FITC/PI染色法進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè) PBS洗滌轉(zhuǎn)移下的細(xì)胞，用染色結(jié)合液制成單細(xì)胞懸液，再加入染色液，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ANOVA進(jìn)行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1siRNA干擾TWSG1 mRNA表達(dá)效率 siRNA干擾TWSG1 mRNA表達(dá)高(P<0.05)，RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)結(jié)果見圖1。

圖1 干擾后各組細(xì)胞中TWSG1mRNA的表達(dá)

表1 干擾后各組細(xì)胞中TWSG1蛋白的相對(duì)灰度值

*：P<0.05 ，與空白對(duì)照組比較;#：P<0.05 ，與陰性對(duì)照組比較

2.2siRNA干擾組TWSG1的蛋白表達(dá)低 各組細(xì)胞Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2，表1)，siRNA干擾組中TWSG1蛋白表達(dá)受到抑制(P<0.05)，7901-siRNA1尤其顯著。結(jié)合PCR結(jié)果，可認(rèn)為成功構(gòu)建了siRNA干擾TWSG1表達(dá)模型。

1:空白對(duì)照組；2:陰性對(duì)照組；3:7901-siRNA1組；4:7901-siRNA2組；5:7901-siRNA3組

圖2干擾后各組細(xì)胞中TWSG1蛋白的表達(dá)

2.3siRNA干擾TWSG1基因表達(dá)促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖 用CCK8檢測(cè)各組增殖情況，以24 h為基礎(chǔ)，在48、72 h時(shí)，siRNA干擾組SGC-7901細(xì)胞分別增殖339%、850%； 而空白對(duì)照組僅增殖173%、644%。SiRNA干擾組SGC-7901細(xì)胞的增殖與其他兩組比較顯著增加(P<0.05)，見圖3。

2.4siRNA干擾組后細(xì)胞周期的變化 siRNA干擾TWSG1基因表達(dá)促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖，更高比例的細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期,見圖4。

圖3 干擾后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

*：P<0.05，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較

圖4 siRNA干擾后細(xì)胞在不同時(shí)期的百分比

3 討 論

研究表明TWSG1基因編碼保守疏水蛋白，調(diào)控BMP信號(hào)通路[4-5]。目前大部分研究是通過BMP通路探討TWSG1表達(dá)與鐵調(diào)素表達(dá)的關(guān)系；也有研究表明TWSG1基因沉默將導(dǎo)致生物發(fā)生障礙或缺陷，小鼠與斑馬魚等試驗(yàn)均證實(shí)這一觀點(diǎn)[4-5]，可見TWSG1是一個(gè)關(guān)鍵基因?，F(xiàn)有文獻(xiàn)提示TWSG1對(duì)不同器官的腫瘤具有雙向性調(diào)控：在結(jié)腸癌中可能是抑癌基因[8-9]；在乳腺癌中有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的功能[10]。臨床發(fā)現(xiàn)家族性結(jié)腸癌患者均有TWSG1缺失或表達(dá)低下[9]，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也顯示TWSG1對(duì)結(jié)腸癌有抑制作用。推測(cè)TWSG1在結(jié)腸癌中是抑癌作用，在信號(hào)通路中，TWSG1是一種富含亮氨酸的分泌蛋白，與BMP結(jié)合蛋白作用，通過USP53途徑抑制細(xì)胞增殖。以TWSG1促進(jìn)乳腺癌發(fā)生為例，TWSG1是BMP的結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞外的BMP2、BMP4、BMP7等配體[11]。青春期時(shí)在肌上皮和終末芽體細(xì)胞中均可表達(dá)TWSG1，在導(dǎo)管成熟后，主要表達(dá)限于肌上皮層。TWSG1的全缺失導(dǎo)致導(dǎo)管伸長(zhǎng)延遲，二級(jí)分支減少，末端芽增大，這與腔上皮細(xì)胞數(shù)量的增加和細(xì)胞凋亡的減少有關(guān)。在胚胎乳腺發(fā)育中，當(dāng)BMP靶基因的表達(dá)降低、BMP信號(hào)傳導(dǎo)降低的同時(shí)，pSMAD1、5、8水平也對(duì)應(yīng)降低。管腔特異性的GATA-3在TWSG1-/-胚胎乳腺中減少。TWSG1對(duì)BMP信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)使正常導(dǎo)管伸長(zhǎng)，導(dǎo)管進(jìn)行分支，管腔形成和出生后胚胎乳腺中的肌上皮區(qū)室化?？傊?，TWSG1啟動(dòng)子區(qū)域中CpG島的異常甲基化可能在暴露于不利條件時(shí)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞活力或分化，最終導(dǎo)致腫瘤。為何一個(gè)基因，在不同組織里卻有截然不同的作用呢？這還要從TWSG1與BMP之間的關(guān)系入手。TWSG1與BMP結(jié)合蛋白相互作用，TWSG1可以作為BMP拮抗劑[12]和激動(dòng)劑[13]。BMP對(duì)癌癥有一定的抑制作用[14-15]，由于TWSG1對(duì)BMP的不同作用，導(dǎo)致了TWSG1在不同組織里有促進(jìn)或抑制癌癥的功能。本研究結(jié)果提示TWSG1極可能是BMP激動(dòng)劑，siRNA干擾TWSG1后其表達(dá)下調(diào)，與BMP作用弱化，使SGC-7901細(xì)胞株增殖。

本研究重點(diǎn)研究了TWSG1表達(dá)異常對(duì)SGC-7901增殖的影響。在培養(yǎng)48、72 h時(shí)，在siRNA誘導(dǎo)低表達(dá)TWSG1調(diào)控下的SGC-7901的增殖速度是空白對(duì)照組的1.96、1.32倍。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，siRNA干擾使TWSG1表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)的TWSG1促進(jìn)SGC-7901的增殖。TWSG1對(duì)SGC-7901的增殖能力有顯著影響。

總之，本研究的結(jié)果表明siRNA干擾TWSG1基因表達(dá)將對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖產(chǎn)生明顯影響，有顯著促進(jìn)作用。TWSG1很可能是一種抑癌基因，提示TWSG1基因可能是潛在的胃癌治療靶點(diǎn)。此外由于胃癌與TWSG1的相關(guān)研究較少，因此本研究對(duì)后續(xù)TWSG1基因在胃癌中的功能、分子機(jī)制的研究具有重大意義，為胃癌發(fā)展的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為胃癌的個(gè)性化治療以及基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過基因篩查可以預(yù)判出胃癌高危人群，在臨床治療上未嘗不是一種有效治療手段。