參附注射液對大鼠膽道缺血再灌注后損傷的保護(hù)作用

張國欣 張凌云 譚萍

【摘要】目的：觀察參附注射液對大鼠膽道缺血再灌注的保護(hù)作用及其對細(xì)胞凋亡的影響，并探討其中可能的保護(hù)機(jī)制。方法：60只清潔級SD雄性大鼠隨機(jī)分為六組，每組10只，分別為：假手術(shù)對照組、缺血再灌注組、參附注射液組（15mL/kg組、10mL/kg組、5mL/kg組）和依達(dá)拉奉組。術(shù)后4h采取血清及肝組織，應(yīng)用免疫組化SP法檢測膽管組織TNF-a、Fas的表達(dá)，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變;測定丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性;測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）。結(jié)果：與假手術(shù)對照組比較，缺血再灌注組ALT、ALP、TBIL水平顯著升高，膽管組織SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，病理學(xué)結(jié)果顯示膽管組織損傷明顯，TNF-a、Fas表達(dá)明顯增強(qiáng)。與缺血再灌注組比較，參附注射液15mL/kg組、10mL/kg組均能降低血清ALT、ALP、TBIL水平及膽管組織MDA含量，升高SOD活性;參附注射液5mL/kg組能降低血清ALT水平，升高SOD活性。病理學(xué)結(jié)果顯示參附各劑量組膽管組織損傷明顯減輕，TNF-a、Fas表達(dá)下降顯著。結(jié)論：參附注射液預(yù)處理能夠抑制TNF-a/TNF-R1→Fas/Fas-L死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，拮抗膽管上皮細(xì)胞的凋亡，改善膽管功能，有效降低肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥。

【關(guān)鍵詞】參附注射液;缺血再灌注;膽管組織細(xì)胞凋亡

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）1-0015-05

ALPandTBILwereMeasured.ResultComparedwithShamgroup，thelevelsofALT，AST，TBILinserumandthecontentsofMDAweresignificantlyincreased，theactivityofSODinbileducttissueweredecreasedinIRgroup.PathologicalresultsshowedthatthebileducttissueinjurywasmoreobviousinIRgroup.TheexpressionofTNF-αandFaswereincreasedobviously.comparedwiththeIRgroup，thelevelsofALT，AST，TBILinserumandthecontentsofMDAinbileducttissueweredecreasedwhiletheactivityofSODwereincreasedinSFdosegroups（15、10mL/kg）;ThelevelsofALTinserumweredecreasedwhiletheactivityofSODwereincreasedinSFdosegroup（5mL/kg），ThepathologicalchangesofbileductinjurycouldbeimprovedinSFeachdosegroup（15、10、5mL/kg），TheexpressionofTNF-αandFasweredecreasedobviously.ConclusionShenfuinjectioncaninhibitsexpressionsofTNF-aandFas，regulatetheapoptosisofbileductcells，improvebileductfunctionandreducebiliarytractcomplicationsafterlivertransplantation.

Keywords：ShenfuInjection;IschemiaReperfusionInjury;BileDuctTissue;CellApoptosis

臨床研究顯示，膽道并發(fā)癥作為影響肝移植術(shù)后遠(yuǎn)期療效的重要并發(fā)癥，其發(fā)病率為7%～25%，且更容易發(fā)生在活體和心腦死亡供體肝移植術(shù)后，是影響患者術(shù)后長期生存率和移植肝臟無功能的主要原因[1-3]，如何避免或減輕供肝缺血再灌注后的膽道損傷已成為研究熱點。參附注射液源自中醫(yī)古方參附湯，由人參、附子制備而成，主要成分為人參皂甙和烏頭類生物堿，因其抗自由基、抗Ca2+超載，改善微循環(huán)等“多靶效應(yīng)”廣泛應(yīng)用于臨床，尤其是在心、肺、肝等臟器缺血再灌注損傷方面，具有明顯的保護(hù)作用[4-8]，但目前對膽道系統(tǒng)缺血再灌注損傷的作用效應(yīng)及其機(jī)制尚不十分清楚。本實驗通過建立大鼠的膽道缺血再灌注模型，觀察并探討參附注射液對其可能的保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1試驗藥物參附注射液（每支10mL，每毫升含生藥紅參100mg、附子100mg，批號：Z51020664，三九制藥有限公司），依達(dá)拉奉注射液（批號：080511，南京先聲東元制藥有限公司）。

1.2動物清潔級健康雄性SD大鼠60只，體重（260±20）g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，自由進(jìn)食，飲水，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：0001478。

1.3試劑TNF-a、Fas免疫組化試劑盒，SP試劑盒均購自武漢博士德公司，TNF-a和Fas稀釋濃度均為1：150。超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒購自南京建成生物研究所。

1.4儀器全自動生化分析儀（奧林巴斯），病理切片機(jī)和醫(yī)學(xué)顯微照相系統(tǒng)為德國萊卡。

1.5方法參照Peralta等[9]建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。采用乙醚麻醉，取上腹正中切口，分離并暴露肝門部，無損傷血管夾鉗夾閉肝左、中門靜脈及肝動脈分支，造成70%的熱缺血，60min后松開血管鉗恢復(fù)血流即行再灌注，于再灌注4h后抽取腹主動脈血標(biāo)本。取左肝固定部位組織，大小適中，一塊置于-70℃冰箱保存，用于組織MDA、SOD的統(tǒng)一測定;另一塊用10%中性甲醛固定，用于組織形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化染色。

1.5.1分組60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、依達(dá)拉奉組、參附注射液15mL/kg組、參附注射液10mL/kg和參附注射液5mL/kg組，每組10只。假手術(shù)組：僅游離肝臟，不阻斷血流。IR組：行肝門阻斷。參附注射液組：在行缺血再灌注術(shù)前，每天腹腔注射15mL/kg、10mL/kg、5mL/kg不同劑量的參附注射液，連續(xù)3天，第3天于術(shù)前30min給藥。依達(dá)拉奉組和IR組大鼠同樣方法分別給予依達(dá)拉奉10mL/kg及生理鹽水15mL/kg，除假手術(shù)組（Sham）外，其它5組均與第3天手術(shù)，給藥期間常規(guī)喂養(yǎng)。

1.5.2血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）濃度測定使用全自動生化分析儀測定不同時間點血清ALT、ALP及TBIL濃度，作為肝缺血再灌注術(shù)后膽道損傷的標(biāo)志。

1.5.3膽管組織TNF-α、Fas的檢測選用SP免疫組化試劑盒，TNF-α、Fas稀釋度均為1∶150，具體步驟按說明書操作，TNF-α、Fas主要表達(dá)于細(xì)胞漿，呈棕色。應(yīng)用Laica圖像分析系統(tǒng)，光鏡放大400倍攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)。每張切片隨機(jī)選取5個區(qū)域，計算每張切片的平均光度，陽性單位。

1.5.4肝組織SOD和MDA的測定準(zhǔn)確稱取冰凍肝臟組織100mg，按說明書操作，手工勻漿制成10%的組織勻漿，低溫3000r/min離心12min上清液，采用化學(xué)比色法測定組織勻漿上清液SOD活性、MDA含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0軟件，計量資料以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，行方差分析q檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血清酶學(xué)指標(biāo)與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組的血清ALT、ALP、TBIL水平均顯著升高，表明造模成功;與缺血再灌注組比較，參附注射液15mL/kg組、10mL/kg、5mL/kg組和依達(dá)拉奉組可明顯減低血清ALT、ALP及TBIL的水平，參附注射液15mL/kg組的ALT、ALP水平明顯下降，詳見表1。

2.3組織病理學(xué)觀察

2.3.1病理學(xué)觀察光鏡下假手術(shù)組膽管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，無炎細(xì)胞聚集;缺血再灌注組膽管可見上皮細(xì)胞明顯腫脹變性，有灶狀或片狀壞死脫落，大量中性粒細(xì)胞浸潤;參附注射液5mL/kg組可見膽管上皮細(xì)胞水腫、灶狀壞死脫落雖較缺血再灌注組減輕，但上皮連續(xù)不完整，有較多中性粒細(xì)胞浸潤;參附注射液15mL/kg組、10mL/kg組和依達(dá)拉奉組病理改變明顯減輕，膽管上皮連續(xù)尚完整，僅見少量中性粒細(xì)胞浸潤。

2.3.2膽管上皮細(xì)胞中TNF-α、Fas的表達(dá)TNF-α、Fas主要表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞胞漿中。假手術(shù)組膽管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核藍(lán)染，背景染色淺，無明顯非特異性染色;缺血再灌注組膽管上皮細(xì)胞胞漿可見多量棕黃色粗顆粒，呈彌漫性分布;參附注射液5mL/kg組可見一定量淡/棕黃色顆粒，散在分布;參附注射液15mL/kg組、10mL/kg組和依達(dá)拉奉組膽管上皮細(xì)胞胞漿可見少量淡黃色細(xì)顆粒，程度較其他組減輕，但比假手術(shù)組明顯，見圖1、表3。

3討論

缺血再灌注損傷是移植肝膽管必然經(jīng)歷的病理生理過程，肝動脈和膽道系統(tǒng)的完整性、通暢性與膽道并發(fā)癥的發(fā)生有著重要關(guān)系。肝動脈終末分支-膽管周圍毛細(xì)血管叢是肝內(nèi)膽管唯一血供，長時間的缺氧會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、腫脹明顯，再灌注時導(dǎo)致血液再灌流減少;膽管上皮細(xì)胞極易活化，活化的膽管細(xì)胞可迅速產(chǎn)生釋放大量的毒性氧自由基，導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化劑SOD、谷胱甘肽含量明顯減少[10]，并分泌大量炎癥介質(zhì)和肽類物質(zhì)，如TNF-α、NO、IL-1等，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、血小板粘附聚集，加重毛細(xì)血管狹窄，阻塞血液灌流，引起膽管微循環(huán)障礙，又進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的損傷，形成惡性循環(huán)，進(jìn)而引起膽汁淤積、高膽紅素血癥，甚至移植肝功能喪失等后果。此外，游離的大鼠膽管上皮細(xì)胞在缺氧4h，再灌注60或120min后發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡[11]，提示膽管上皮細(xì)胞凋亡也是缺血再灌注損傷的特征性改變。

TNF-α主要由激活的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分泌，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。在缺血再灌注過程中，TNF-α濃度迅速增加，并表現(xiàn)出比其他細(xì)胞因子更高的靈敏度，因此TNF-α表達(dá)水平可反映機(jī)體損傷程度，被視為炎癥指標(biāo);在TNF-α的刺激下，細(xì)胞粘附分子（ICAM-1）表達(dá)增高，促進(jìn)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，加重動脈粥樣硬化的進(jìn)程[12]。

TNF-α和Fas還是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵性的因子，TNF-α與其受體TNF-R1結(jié)合、Fas與其配體FasL結(jié)合后，生成相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域簇集TRADD、FADD，與Caspase-8前體N末端的死亡效應(yīng)域相作用，激活Caspase-8，啟動Caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。Chen等[13]肝缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)參附注射液通過下調(diào)TNF-α，從而減少肝實質(zhì)細(xì)胞凋亡。KumarA等[14]在甲亢誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡的研究中也證實，TNF-α和Fas水平明顯升高，且TNF-α可上調(diào)Fas表達(dá)。本實驗結(jié)果顯示，與缺血再灌注組比較，參附注射液5mL/kg組、參附注射液10mL/kg和參附注射液15mL/kg組膽管上皮細(xì)胞TNF-α、Fas表達(dá)量和表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱;參附注射液15mL/kg組肝門部膽管上皮細(xì)胞中TNF-α、Fas陽性表達(dá)率分別為24.8%、22.4%，較同一時相缺血再灌注組（36.7%、32.6%）明顯下降（P<0.05）;匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞中TNF-α、Fas的陽性表達(dá)率，參附注射液15mL/kg組分別是20.1%、17.3%，較缺血再灌注組（31.2%、25.9%）也明顯減少（P<0.01）。Zhu等[15]的研究表明參附注射液能顯著誘導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴性舒張，有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。Yan等[16]在大鼠心衰模型研究中發(fā)現(xiàn)參附注射液可降低心衰細(xì)胞的陽性率，抑制Caspase-3的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。由此可以推測，參附注射液可改善微循環(huán)，并通過干預(yù)調(diào)節(jié)TNF-α、Fas/FasL死亡信號通路而抗膽管上皮細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮膽道保護(hù)作用。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，當(dāng)組織抗氧化劑耗盡時，會引起細(xì)胞損傷及細(xì)胞膜的破裂;超氧化物歧化酶（SOD）是一種金屬酶，能催化O2-到O2和H2O2的歧化，直接滅活氧自由基，抑制白細(xì)胞的粘附和Na+內(nèi)流，修復(fù)組織損傷。本實驗中，缺血再灌注組大鼠血清ALT、ALP及TBIL持續(xù)升高，血漿SOD活力明顯減弱，MDA含量顯著增高;應(yīng)用不同劑量的參附注射液處理后，ALT、ALP及TBIL顯著降低，血漿SOD活力增強(qiáng)，MDA含量明顯下降，均較缺血再灌注組明顯改善。研究表明，參附注射液能穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少心肌酶的釋放，保護(hù)缺血的心肌細(xì)胞;還可滅活黃嘌呤氧化酶，清除氧自由基，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，通過抑制NF-κB活性，降低肝臟Kupffer細(xì)胞激活，減少TNF-α、IL-1等促炎因子的釋放，保護(hù)肝細(xì)胞的活性[17-20]。實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)參附注射液15mL/kg組、10mL/kg組效果尤為明顯（P<0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，提示參附注射液可干預(yù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，降低膽管細(xì)胞氧耗，加速自由基的排泄，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，在維護(hù)機(jī)體氧化與抗氧化之間的平衡方面作用顯著。

綜上所述，參附注射液可以通過抑制TNF-a/TNF-R1→Fas/Fas-L死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減輕膽管上皮細(xì)胞的凋亡，從而有效保護(hù)膽管功能，減輕肝移植缺血再灌注后膽道并發(fā)癥的發(fā)生，為臨床治療提供一條可行性思路。

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（收稿日期：2018-11-12編輯：劉斌）