骨形態(tài)發(fā)生蛋白9基因敲除小鼠的構(gòu)建

周珂，辛智倩，劉佩娟，馬翠，師長宏，王華，張海*

(1. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族，是一類多功能生長因子。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)超過20種BMP相關(guān)蛋白，并根據(jù)其氨基酸序列及功能將其分為四種亞家族。其中，BMP9和BMP10組成一種亞家族，在胚胎干細(xì)胞分化、成骨形成、血管生成、糖脂代謝等方面中起到重要作用[1]。BMP9作為成骨作用最強(qiáng)的BMPs家族成員也受到越來越多的關(guān)注。

BMP9又稱為生長分化因子2(growth and differentiation factor 2, GDF2)，主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，且有研究發(fā)現(xiàn)其mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌中也有少量表達(dá)[2]。BMP9不同于其他BMPs家族成員的是其對受體的選擇性以及對信號調(diào)節(jié)的敏感性，它與激活素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase 1, ALK1)有高度親和力[3]，結(jié)合后能夠激活Smad依賴性BMP信號通路，從而影響細(xì)胞生長發(fā)育等生理過程[4]。近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道BMP9參與多種生物學(xué)進(jìn)程，當(dāng)BMP9信號失調(diào)時(shí)，能夠誘發(fā)多種疾病，如肺動(dòng)脈高壓、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥，肝疾病等[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化疾病進(jìn)程中，肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白合成增多是纖維化形成的一個(gè)重要機(jī)制，BMP9能夠通過與ALK1或ALK1與ALK5復(fù)合體結(jié)合，使Smad1/5/8磷酸化，同時(shí)激活其他肝纖維化相關(guān)受體，上調(diào)ECM蛋白的表達(dá)，因此其具有促纖維化的功能[8]。但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，針對這些疾病的相應(yīng)治療也不完善。

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的日益成熟，用于各種疾病研究的動(dòng)物模型也逐漸增多。通過構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型，能夠快速了解目的基因?qū)膊∵M(jìn)程的作用，幫助研究者明確其作用機(jī)制，以此找到有效方法來預(yù)防和治療疾病。為進(jìn)一步研究BMP9對肝纖維化的影響，本研究以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建BMP9基因敲除小鼠。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級C57BL/6小鼠，體重20～22 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(陜)2014-002】，6～8周齡ICR母鼠購于北京維通利華公司【SCXK(京)2012-0001】，均飼養(yǎng)于屏障設(shè)施【SYXK(陜)2014-001】中。

1.1.2 試劑與儀器

sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒及純化試劑盒購自Ambion公司。Cas9 mRNA購自南通百奧邁科公司。DNTPs和Taq酶購自Takara公司。BMP9抗體購自Proteintech公司。pX330質(zhì)粒由北京艾德摩公司提供。PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生物公司。小鼠基因組DNA提取試劑盒由福際生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)Genbank報(bào)道的Bmp9基因序列，確定Bmp9基因敲除的靶位點(diǎn)。應(yīng)用http://crispr.mit.edu 網(wǎng)站分析并設(shè)計(jì)20 bp的sgRNA序列，再根據(jù)選擇的sgRNA序列，合成一對序列互補(bǔ)的DNA Oligos。將Oligos退火后以T4連接酶連接到帶有T7啟動(dòng)子的pX330質(zhì)粒載體上，構(gòu)建含有sgRNA的重組質(zhì)粒。

1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄

上述質(zhì)粒和pX330為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增sgRNA序列，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄按文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[9]，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 顯微注射及胚胎移植

6周齡C57BL/6雌性小鼠超數(shù)排卵后與雄鼠合籠，挑選見栓雌鼠，剖開腹腔，在輸卵管壺腹部收集受精卵細(xì)胞。將轉(zhuǎn)錄好sgRNA和Cas9以2∶1混合，運(yùn)用Eppendorf NK2 顯微注射儀將混合物直接注射入受精卵細(xì)胞中，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑選成活受精卵細(xì)胞移植入假孕ICR母鼠輸卵管中。

1.2.4 基因型鑒定和純合子的篩選

待首建鼠發(fā)育至1周時(shí)，剪取鼠尾，加入裂解液后，通過試劑盒提取基因組DNA，以此作為PCR模板，進(jìn)行基因突變鑒定。將突變的首建鼠與野生型C57BL/6交配，得F1代雜合子，F(xiàn)1代互交即可篩選出F2代純合子。

1.2.5 BMP9在肝組織中的表達(dá)

(1)Western Blot

處死小鼠后取肝組織，加入RIPA裂解液后勻漿，提取總蛋白。蛋白定量后，加入RIPA裂解液和5×上樣緩沖液配成樣品，90℃水浴10 min使蛋白變性，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉2 h，一抗為BMP9抗體，稀釋比例為1∶500，4℃過夜孵育，二抗為山羊抗兔工作液，稀釋比例1∶4000，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，成像分析。

(2)qPCR

處死小鼠后取肝組織，加入TRIzol勻漿裂解，提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過BMP9特異性引物進(jìn)行qPCR檢測。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用 2-△△CT值計(jì)算目的基因相對表達(dá)量，其中各組織中Bmp9表達(dá)量以心臟為對照，敲除小鼠體內(nèi)Bmp9表達(dá)量以野生型小鼠為對照。

(3)免疫組化

處死小鼠后取肝組織，使用4%多聚甲醛固定，24 h后石蠟包埋，切片。通過免疫組化檢測BMP9表達(dá)。一抗為BMP9抗體，1∶200的比例稀釋；二抗為山羊抗兔工作液。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建質(zhì)粒及體外轉(zhuǎn)錄

參照Genbank報(bào)道的Bmp9序列，利用http://crispr.mit.edu網(wǎng)站設(shè)計(jì)針對Bmp9基因第1外顯子的一段sgRNA序列，Bmp9-上游引物：5’-CACCgtgtacaagtcgatcatgtac-3’；Bmp9-下游引物：5’-AAACgtacatgatcgacttgtacac-3’。sgRNA序列兩端引入Bbs I酶切位點(diǎn)后交由公司合成兩端互補(bǔ)序列。合成的sgRNA退火后克隆入pX330質(zhì)粒。以此為模板，通過PCR大量擴(kuò)增sgRNA，純化后的sgRNA，在T7啟動(dòng)子的介導(dǎo)下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，得到大小約為112 bp的PCR產(chǎn)物(見圖1)。通過紫外分光光度計(jì)檢測，得出OD260/230=2.3，OD260/280=1.9。

2.2 基因型鑒定

Cas9和sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯微注射入供體受精卵細(xì)胞后，將其移植到假孕受體母鼠體內(nèi)，分娩得到F0代小鼠。F0代動(dòng)物經(jīng)過提取鼠尾DNA測序后，結(jié)果顯示存在兩種基因型的突變小鼠，一種為13 bp缺失并伴有1 bp插入突變(見圖2A)，另一種為5 bp缺失突變(見圖2B)。F0代小鼠與野生型小鼠交配獲得F1代雜合子，雜合子再經(jīng)過互交篩選得到F2代純合子。

圖1 sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Figure 1 Transcription products of sgRNA

圖2 Bmp9基因敲除小鼠的基因型Figure 2 Genotype of the Bmp9 knockout mice

2.3 BMP9在敲除小鼠肝組織中的表達(dá)

2.3.1 BMP9 mRNA和蛋白在敲除小鼠中的表達(dá)

為了準(zhǔn)確研究BMP9功能，我們首先檢測野生型小鼠心臟、肝、脾、肺、腎等主要臟器中BMP9 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP9主要在小鼠肝臟表達(dá)，其他臟器表達(dá)很低或不表達(dá)(圖3)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]。因此在敲除小鼠表型鑒定中，我們只提取敲除小鼠肝臟的mRNA和蛋白進(jìn)行分析，以BMP9特異性引物(上游引物序列為5’-CCACCCCAGTACATGATCGAC-3’；下游引物序列為5’-GGATGTGCTTCTGAAAGGGGA-3’。)通過qPCR檢測后發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中mRNA幾乎不表達(dá)，Western blot也證明BMP9蛋白表達(dá)水平很低(圖4、5)。這些結(jié)果表明BMP9已成功敲除。

圖3 qPCR檢測BMP9在野生型小鼠各臟器中的表達(dá)Figure 3 Expression of BMP9 in different organs of wide-type mice detected by qPCR

圖4 qPCR檢測BMP9在肝組織中的表達(dá)Figure 4 Expression of BMP9 in the liver detected by qPCR

圖5 Western blot檢測BMP9在肝中的表達(dá)Figure 5 Expression of BMP9 in the liver detected by Western blot

2.3.2 免疫組化

取F2代小鼠肝組織，在 4%多聚甲醛中固定，24 h后石蠟包埋，切片，進(jìn)行免疫組化。結(jié)果顯示(見圖6)與野生型C57BL/6相比，BMP9在基因敲除小鼠肝組織中的表達(dá)量顯著下降。

圖6 免疫組化檢測BMP9在肝中的表達(dá)(×40)Figure 6 Expression of BMP9 in the liver detected by immunohistochemistry(×40)

3 討論

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系統(tǒng)是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，CRISPR被稱為“規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列”，是在一些細(xì)菌基因組內(nèi)存在的一系列成簇排列的DNA序列，這些重復(fù)序列和很多能夠侵入細(xì)菌的噬菌體的DNA序列相同。研究者發(fā)現(xiàn)，噬菌體病毒或外源質(zhì)粒入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠識別這些外源DNA，這些序列在被轉(zhuǎn)錄成為RNA后，能夠和細(xì)菌產(chǎn)生的CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白形成復(fù)合體，對Cas9蛋白起到導(dǎo)向作用，因此這段RNA也被稱為導(dǎo)向RNA(gRNA)。當(dāng)復(fù)合體檢測到入侵的DNA和gRNA序列一致時(shí)，Cas9蛋白就能夠切割入侵的DNA，達(dá)到防御的目的。以此為基礎(chǔ)衍生的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在基因治療、動(dòng)物模型等領(lǐng)域顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，與傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)可實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因敲入等，是構(gòu)建基因修飾動(dòng)物的重要工具。本研究我們針對Bmp9外顯子設(shè)計(jì)20 bp的sgRNA序列，體外轉(zhuǎn)錄后可介導(dǎo)Cas9在靶向區(qū)域定向切割，引起B(yǎng)mp9基因讀碼框位移，從而導(dǎo)致BMP9蛋白表達(dá)水平改變，證明CRISPR/Cas9基因編輯是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物良好工具。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，BMP9可以與ALK1、BMPRⅡ、內(nèi)皮素等結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞，激活BMP相關(guān)信號通路，從而參與多種生理活動(dòng)[10]。BMP9早期的研究主要集中在血管生成領(lǐng)域，如肺動(dòng)脈高壓、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥。隨著對BMP9了解的深入，研究者發(fā)現(xiàn)其在腫瘤、肝、神經(jīng)系統(tǒng)等方面都有著一定的影響，Maegdefrau等[11]通過RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)BMP9在肝細(xì)胞性肝癌Hep3B和PLC/PRF/5細(xì)胞中高表達(dá)，Herrera 等[12]發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，激活Smad1/5/8磷酸化。這提示我們Bmp9基因敲除后，可能會改善肝疾病進(jìn)程，因此通過敲除Bmp9基因構(gòu)建肝疾病模型，能夠?yàn)楹罄m(xù)研究提供良好的研究條件。