白毛黑眼兔與日本大耳白兔胰島素抵抗動(dòng)脈粥樣硬化模型的比較

劉軍平，潘永明，陳民利，朱科燕，蔡月琴，呂濤，黃俊杰

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

隨著人們生活水平的提高以及膳食結(jié)構(gòu)的改變，代謝性綜合征和心腦血管疾病的發(fā)生率明顯增加。目前認(rèn)為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是代謝綜合征和心腦血管疾病共同病理基礎(chǔ)，且IR可引發(fā)一系列代謝紊亂和心血管疾病，從而加重動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變程度[1]。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，IR可通過含有高糖和高脂肪的飲食誘導(dǎo)建立[2]。盡管飲食誘導(dǎo)可致大鼠IR，但由于大鼠低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受體缺陷[3]，脂蛋白代謝與人類大不相同，并對(duì)飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥和AS具有抗性。與人類不同，大鼠和小鼠都缺乏膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這是一種重要的調(diào)節(jié)因子。脂蛋白代謝及其主要脂蛋白是高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，而不是LDL。因此，難以使用這些動(dòng)物模型來闡明IR與AS之間的關(guān)系。相反，兔作為草食動(dòng)物，對(duì)膳食脂肪和膽固醇非常敏感，可迅速發(fā)展為高脂血癥和AS。此外，與人類一樣，但與大小鼠不同，兔血漿中含有豐富的膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且其脂蛋白原富含LDL。因此，兔可能是研究肥胖、IR和代謝綜合征有價(jià)值的模型。

近來認(rèn)為，微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTTP)可加速甘油三酯、膽固醇與磷脂酰膽堿從供體小單層囊泡中轉(zhuǎn)移至受體小單層囊泡[4]，同時(shí)對(duì)脂蛋白的正常組裝與分泌起重要的作用[5]。核因子E2(nuclear factor-like 2, Nrf2)介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)是一種主要的細(xì)胞防御機(jī)制，Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡[6]。Nrf2氧化應(yīng)激與人類發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病和老化過程有關(guān)[7]。超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1) 廣泛存在于自然界一切生物體內(nèi)，通過催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，減輕或消除氧自由基對(duì)機(jī)體的氧化或過氧化損害[8]。通過對(duì)肝中MTTP、Nrf2與SOD1基因表達(dá)的變化，可了解高脂飼喂對(duì)體內(nèi)脂代謝的影響。

白毛黑眼(white hair black eye rabbit，WHBE)兔是本中心于1998年從日本大耳白(Japanese white rabbit，JW)兔生產(chǎn)群中發(fā)現(xiàn)并自主培育，已形成封閉群。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)WHBE兔IR-AS模型，并與JW兔比較，分析這兩種品系兔IR-AS模型的表型差異以及肝組織中MTTP、Nrf2和SOD1基因表達(dá)的變化，探討WHBE兔IR-AS疾病可能的易感機(jī)制，為WHBE兔在肥胖、代謝綜合征和心腦血管疾病中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)JW與WHBE兔各12只，體重為1.8～2.0 kg，3～4月齡，雌雄各半，購自新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場【SCXK (浙)2015-0004】，飼養(yǎng)于本中心兔實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0184】，室溫20～22℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替。所有操作均遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)要求(倫理批準(zhǔn)號(hào)：ZSLL-2016-114)。

1.1.2 主要試劑及儀器

全自動(dòng)生化分析儀(日立)，徠卡病理切片儀(徠卡公司)，全自動(dòng)病理掃描切片儀(濱松公司)、連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)，熒光定量PCR儀(ABI)，微量核酸測定儀(Thermo)；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血糖試劑盒(上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和胰島素試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 IR-AS模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，各品系兔隨機(jī)分成2組，即JW兔正常對(duì)照組(JW rabbit normal control group，JWNC)和高脂高糖飲食組(JW rabbit high fat/high sugar diet group，JWHF)；WHBE兔正常對(duì)照組(WHBE rabbit normal control group，WBNC)和高脂高糖飲食組(WHBE rabbit high fat/high sugar diet group，WBHF)，每組6只。NC組飼喂普通飼料；HF組飼喂高脂高糖飼料(飼料配方：0.25%膽固醇、10%起酥油、30%蔗糖、59.75%基礎(chǔ)飼料)，每日兩次，連續(xù)造模12周。

1.2.2 糖脂代謝指標(biāo)測定

造模12周后禁食16 h，取耳中動(dòng)脈抗凝血4 mL，分離血漿，測定TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，計(jì)算LDL-C/HDL-C比值；測定空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FINS)水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，即FPG×FINS/22.5。

1.2.3 靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)(intravenous glucose tolerance test，IVGTT)

兔禁食16 h后，耳緣靜脈注射葡萄糖溶液(0.6 g/kg)，分別于注射前(0 min)、注射后5、15、30、60、90、120 min，取血測定血糖和胰島素，計(jì)算血糖和胰島素曲線下面積。

1.2.4 SOD活性和MDA含量的測定

肝組織經(jīng)勻漿后制成5%勻漿液，離心取上清液，按試劑盒說明書分別測定血漿和肝中SOD活性和MDA含量。

1.2.5 病理組織學(xué)觀察

(1)脂肪病理觀察

取腹部脂肪組織， 4%甲醛固定，脫水透明，浸蠟包埋，切片，行HE染色，用Image pro plus 6.0軟件測量10×視野下脂肪細(xì)胞的大小，計(jì)算平均直徑，并分析脂肪細(xì)胞大小分布。

(2)血管HE染色和CD68表達(dá)

取下主動(dòng)脈弓，選取遠(yuǎn)端5 mm處血管環(huán)， 4%甲醛固定，脫水后石蠟包埋切片，HE染色以及CD68免疫組化染色，用Image pro plus 6.0 軟件測量血管內(nèi)斑塊占據(jù)整個(gè)血管面積的百分率和CD68陽性表達(dá)率。

(3)主動(dòng)脈脂質(zhì)分析

取主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈末端血管， 4%甲醛固定，水洗后縱向剖開血管，固定于硅膠板上，經(jīng)70%乙醇6 min處理后，蘇丹IV染色6 min，70%乙醇溶液脫色，數(shù)碼拍照，Image J 軟件分析脂質(zhì)沉積。

1.2.6 肝中MTTP、Nrf2與SOD1基因的表達(dá)

取肝組織提取總RNA和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成(表1)，在PCR儀上檢測目的基因的Ct值，用2-ΔΔCt法計(jì)算MTTP、Nrf2與SOD1的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the used primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組體重和血脂、血糖、胰島素及HOMA-IR的變化

與NC組比，造模12周后HF組血漿TC、TG、LDL-C、HDL-C水平以及LDL-C/HDL-C比值均顯著升高(P< 0.01)，F(xiàn)INS和HOMA-IR指數(shù)顯著增加(P< 0.01)，同時(shí)，WBHF組體重增加顯著(P< 0.01)；另外，WBHF組TG、LDL-C和HOMA-IR指數(shù)均顯著高于JWHF組(P< 0.01)，但WBNC組TC、HDL-C、LDL-C水平則顯著低于JWNC組(P< 0.05，P< 0.01)，見圖1。

2.2 糖耐量試驗(yàn)結(jié)果

與NC組比，造模12周后HF組糖耐量與胰島素釋放曲線及曲線下面積均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，同時(shí)WBHF組相較于JWHF組的糖耐量曲線下面積顯著增加(P< 0.01)(圖2)。

注：與NC組比，*P< 0.05,**P < 0.01。兩品系兔間比較，#P< 0.05,##P < 0.01。圖1 各組體重、血脂、FBG、FINS及HOMA-IR的變化Note. Compared with the NC group,*P< 0.05,**P < 0.01. Compared between the two rabbit strains,#P< 0.05,##P < 0.01.Figure 1 Changes of body weight, blood lipid, FBG, FINS and HOMA-IR in each group

注 與NC組比，*P< 0.05,**P < 0.01；HF組之間相比，#P< 0.05,##P < 0.01。(下圖同)圖2 糖耐量試驗(yàn)結(jié)果Note. Compared with the NC group,*P< 0.05,**P < 0.01. Compared between the HF groups，#P< 0.05,##P < 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Results of intravenous glucose tolerance test

2.3 血漿及肝中SOD活性與MDA含量的變化

與NC組比，WBHF組血漿與肝SOD活性均顯著下降(P< 0.05)，JWHF組血漿SOD活性顯著降低(P< 0.05)；HF組MDA含量則顯著升高(P< 0.01)；另外，WBHF組血漿和肝MDA含量顯著高于JWHF組(P< 0.05)(圖3)。

2.4 脂肪細(xì)胞分布情況

與NC組相比，HF組脂肪細(xì)胞肥大(P< 0.01)，并且細(xì)胞大小分布向大的方向偏移(P< 0.05，P< 0.01)， 同時(shí)，WBHF組的脂肪細(xì)胞平均直徑顯著高于JWHF組(P< 0.01)(圖4)。

2.5 各組主動(dòng)脈病理組織學(xué)評(píng)估

蘇丹IV染色顯示，與NC組比，HF組紅色脂質(zhì)沉積和AS斑塊明顯(P< 0.01)；同時(shí)WBHF組的脂質(zhì)沉積和斑塊顯著高于JWHF組(P< 0.01)(圖5A和圖5C)。HE染色顯示，NC組主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整且?。籋F組主動(dòng)脈內(nèi)膜增生明顯，斑塊明顯向管腔內(nèi)凸出，可見大量的泡沫細(xì)胞，中內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊(圖5B)。與NC組比，HF組內(nèi)膜斑塊面積/管腔面積和CD68陽性表達(dá)均顯著增加(P< 0.01)，且WBHF組顯著高于JWHF組(P< 0.05，P< 0.01)(圖5D和圖5E)。

圖3 各組血漿和肝組織中SOD活性和MDA含量的變化.Figure 3 Changes of SOD activities and MDA contents in the rabbit plasma and liver of each group

注：A為脂肪細(xì)胞染色代表圖，B為脂肪細(xì)胞分布，C為脂肪細(xì)胞直徑；圖4 各組脂肪細(xì)胞分布情況Note. A. Representative histopathological image of visceral adipocytes. B Distribution of visceral adipocytes. C, Mean diameter of visceral adipocytes. n=6.Figure 4 The visceral adipocyte distribution in each group

2.6 各組肝SOD1, Nrf2和MTTP mRNA表達(dá)的變化

與NC組比，JWHF組肝Nrf2和MTTP基因表達(dá)顯著上調(diào)(P< 0.01)；但WBHF組肝SOD1基因表達(dá)下調(diào)顯著(P< 0.01)，同時(shí)Nrf2和MTTP基因表達(dá)上調(diào)顯著(P< 0.01)；另外，WBHF組肝SOD1 基因表達(dá)顯著低于JWHF組(P< 0.05)，見圖6。

注：A為主動(dòng)脈蘇丹IV染色代表圖，B為血管HE和CD68免疫組化代表圖 (×1.25)及其黑色方框內(nèi)為HE血管局部放大圖(×10)，C為主動(dòng)脈斑塊面積百分比，D為內(nèi)膜斑塊面積/管腔面積比，E為CD68陽性面積占比。圖5 各組主動(dòng)脈病理組織學(xué)評(píng)估Note. A. Representative image of aortae in each group. Sudan IV staining. B. Representative histopathological images of aorta rings. H&E staining and immunohistochemical staining with CD68 against macrophages (Mφ) (×1.25) and the enlarged view in the black square frame (× 10). C. Percentage of aortic plaque area by Sudan IV staining. D. Intimal plaque area/lumen area ratios. E. Ratio of CD68-positive cells area.Figure 5 Histopathological evaluation of aortic changes in each group

圖6 各組肝SOD1, Nrf2和MTTP mRNA的變化Figure 6 Expression of SOD1, Nrf2, and MTTP mRNA in the liver tissues

3 討論

眾所周知，IR、AS的發(fā)生是遺傳和環(huán)境互作的結(jié)果，脂代謝紊亂和炎癥是加劇AS的起始[9]。本研究采用高脂高糖飲食誘導(dǎo)建立了WHBE兔IR-AS模型，并與JW兔比較，結(jié)果證實(shí)了高脂高糖飲食后這兩種品系兔均有明顯的血脂紊亂。雖然模型組空腹血糖未見升高，但FINS和HOMA-IR指數(shù)均明顯升高，表明有外周IR。蘇丹IV染色證實(shí)了高脂高糖飲食對(duì)兔AS的易感性，表現(xiàn)出明顯的血管脂質(zhì)沉積和AS。此外，與JW兔比，WHBE兔IR-AS的病變程度明顯加重，主要體現(xiàn)在血脂(TC、LDL-C和TG)、HOMA-IR指數(shù)、糖耐量、氧化應(yīng)激等方面的差異，這些差異可能綜合導(dǎo)致了WHBE兔AS病變的嚴(yán)重性，同時(shí)也反映了兔模型能再現(xiàn)IR與AS密切相關(guān)。

WHBE兔是從JW兔生產(chǎn)群中發(fā)現(xiàn)[10]，并育種保留，經(jīng)過20年的培育后發(fā)現(xiàn)TC水平與JW兔存在差異，如WHBE兔TC及其成分明顯低于JW兔，且相同環(huán)境高糖高脂飲食對(duì)WHBE兔的脂代謝敏感程度顯著高于JW兔，提示除遺傳因素外，環(huán)境因素對(duì)WHBE兔脂代謝影響顯著。糖耐量結(jié)果也發(fā)現(xiàn)WHBE兔的糖耐量曲線下面積和HOMA-IR指數(shù)均高于JW兔。另外，由于游離脂肪酸(FFA)被大量攝取到肝中引起的脂質(zhì)水平的增加[11]，以及MTTP的過度表達(dá)可能會(huì)使肝合成并分泌極低密度脂蛋白(VLDL)增加[12]，并積聚在血漿中。本研究發(fā)現(xiàn)正常WHBE兔存在低水平LDL-C，提示W(wǎng)HBE兔VLDL的分解代謝延遲，VLDL積累進(jìn)一步增強(qiáng)，這可能是其高脂高糖飲食后血脂增加幅度高于JW兔的原因之一，還有待于研究。但應(yīng)該指出的是，RT-PCR分析進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，即在高脂高糖喂養(yǎng)后兔MTTP基因表達(dá)明顯升高，表明循環(huán)中FFA的增加也會(huì)誘發(fā)脂肪肝和脂肪堆積，并降低對(duì)胰島素的反應(yīng)，引起IR[13]?？梢?，脂代謝紊亂是引發(fā)IR、糖尿病、心腦血管疾病的起始因素之一，而WHBE兔對(duì)脂代謝反應(yīng)的易感，使其后續(xù)IR-AS病變嚴(yán)重于JW兔。

氧化應(yīng)激加劇脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)[14]。SOD活性和MDA含量反映了機(jī)體氧化應(yīng)激程度，前者反映清除氧自由基的能力，后者反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度[15]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂高糖飲食后這兩品系兔SOD活性降低和MDA含量升高；且WHBE兔氧化應(yīng)激程度顯著高于JW兔，這與WHBE兔SOD1基因表達(dá)明顯降低，相反JW兔SOD1基因表達(dá)下降不明顯相一致，有力說明了WHBE兔對(duì)脂代謝紊亂的易感性，使其更易受氧化應(yīng)激反應(yīng)攻擊，加重細(xì)胞組織的氧化損傷?？梢姡h(huán)境因素對(duì)WHBE兔的影響更為明顯，這與前期發(fā)現(xiàn)WHBE兔腸道應(yīng)激反應(yīng)易感較為一致[16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2表達(dá)增加伴隨著肝中SOD1的低表達(dá)，提示高脂高糖飲食可能通過增加FFA流入門靜脈系統(tǒng)和肝臟氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)肝臟IR和隨后的脂肪變性[17-18]。

IR和炎癥互為作用，加劇疾病的發(fā)生發(fā)展。高脂高糖飲食后兔脂肪細(xì)胞肥大，且WHBE兔模型組的脂肪細(xì)胞直徑顯著高于JW兔；蘇丹IV染色也顯示W(wǎng)HBE兔主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積明顯多于JW兔，該結(jié)果與血管斑塊面積占比結(jié)果較為一致。另外，WHBE兔斑塊內(nèi)CD68陽性表達(dá)也顯著高于JW兔。臨床發(fā)現(xiàn)AS病變的內(nèi)膜CD68陽性巨噬細(xì)胞與AS病變發(fā)展引起管壁狹窄有密切的相關(guān)性[19]，巨噬細(xì)胞的大量浸潤以及脂質(zhì)壞死核心的增大均與AS的穩(wěn)定程度有關(guān)，這也符合WHBE兔AS斑塊大小明顯高于JW兔較為一致?？梢姡装Y參與了高脂高糖飲食兔IR-AS的過程。

綜上所述，高脂高糖飲食誘導(dǎo)兔的脂代謝紊亂和炎癥，導(dǎo)致IR-AS的發(fā)生，但WHBE兔的病變程度明顯高于JW兔，這可能與這兩品系兔在脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)存在差異有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為深入探討WHBE兔的脂質(zhì)代謝與IR-AS的易感分子機(jī)制提供依據(jù)，并為其遺傳特性研究奠定基礎(chǔ)。