心肌組織特異性Isca1敲除造成新生大鼠心臟結(jié)構(gòu)異常

楊辛蘭，呂丹，張旭，董偉，陳煒，高珊，高凱，史旭東，馬元武,3，張連峰,3*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021； 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100730)

鐵硫簇(iron-sulfur cluster，ISC)基本結(jié)構(gòu)單元有[2Fe-2S]、[3Fe-4S]、[4Fe-4S]及[8Fe-7S]等幾種形式，是存在于TCA循環(huán)中的順烏頭酸酶和延胡索酸酶及線粒體呼吸鏈復(fù)合物等部位的生物體內(nèi)最古老的物質(zhì)之一[1]。鐵硫簇最重要的生物學(xué)功能是作為電子傳遞蛋白的輔助基團(tuán)參與能量轉(zhuǎn)移。鐵硫簇生物合成過程需要IBA57(iron-sulfur cluster assembly)、NFU1(iron-sulfur cluster scaffold)、ISCA1(iron-sulfur cluster assembly 1)等蛋白共同參與完成[2-3]。研究表明，IBA57基因缺陷的純合子在嬰兒出生之前出現(xiàn)明顯的代謝綜合征，出生早期致命，表現(xiàn)為肌張力減退、呼吸功能不全、高血糖、先天性頭小畸形和腦畸形等癥狀[4-5]；NFU1基因缺陷的嬰兒從出生第一天起就出現(xiàn)進(jìn)食困難、肌肉無力、呼吸功能不全、嗜睡和缺乏反應(yīng)能力，并在出生第1個(gè)月內(nèi)死亡[6-7]。ISCA1是[Fe/S]的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在支架蛋白的介導(dǎo)下，傳遞[Fe/S]到呼吸鏈蛋白，并調(diào)節(jié)呼吸鏈蛋白等鐵硫簇[4Fe-4S]蛋白的成熟[8]。Isca1是最近幾年發(fā)現(xiàn)的多發(fā)性線粒體功能障礙綜合征(MMDS)的致病基因，目前研究發(fā)現(xiàn)Isca1在線粒體和胞質(zhì)鐵硫簇生物合成過程中起著重要作用[9]，尤其與鐵硫簇生物合成過程中Fe4S4的成熟密切相關(guān)[10]，但是目前對(duì)Isca1體內(nèi)致病機(jī)制的研究很少，尤其是該基因缺失對(duì)心臟的功能研究尚屬空白。我們的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Isca1基因全身敲除是致死的，并進(jìn)一步建立了Isca1Flox大鼠，本研究利用心肌特異的Cre大鼠(MHC-Cre)[11]與Isca1Flox大鼠雜交，產(chǎn)生了心肌組織特異性Isca1敲除大鼠，分析Isca1敲除導(dǎo)致的心臟病的病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

心肌組織特異性Isca1敲除大鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所基因工程平臺(tái)培育。Isca1Flox大鼠繁育過程所需的8周齡SPF級(jí)SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-001】。大鼠均飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房【SYXK(京)2014-0029】，飼養(yǎng)間溫度(23 ± 2)℃，12/12 h明暗交替照明，動(dòng)物自由飲水及采食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18003。

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；4%甲醛溶液購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；電鏡專用固定液由北京交通大學(xué)電鏡室提供；DNA提取試劑盒(EE101-02)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest Agarose公司；凝膠電泳儀購自美國(guó)伯樂公司；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)購自德國(guó)徠卡公司；PCR儀購自Eppendorf公司、55℃搖床購自日本Taitec公司；氣體麻醉機(jī)購自英國(guó)斯特普科技有限公司；7.0 T/160 mm磁共振儀購自美國(guó)Varian公司；透射電鏡購自日本電子(JEOL)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

繁育心肌組織特異性Isca1敲除大鼠，在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。加入100 μL LB2和20 μL proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解后參照說明書進(jìn)行DNA提取步驟，最后12 000 r/min 離心2 min，洗脫DNA，收集到干凈離心管中，保存至4℃冰箱。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)鑒定心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的基因型

根據(jù)樣品數(shù)量配制所需的PCR反應(yīng)體系，包括雙蒸水、DNA聚合酶、引物、dNTP、DNA模板等，將樣品加入PCR反應(yīng)體系，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，混合均勻后置于PCR儀。本實(shí)驗(yàn)共使用兩對(duì)引物，ISCA1-LOXP上游引物序列為5’ATGGTTCCAGCACTTTGAAGG；下游引物序列為5’AAGCTAATATGACAGTGGTGAGGC。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系為20 μL，片段大小為WT 1333 bp，KI1401 bp；Cre上游引物序列為：5’AACATGCTTCATCGTCGGTC；下游引物序列為5’GTGCCTTCTCTACACCTGCG。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；59℃退火30 s；72℃延伸30 min，反應(yīng)體系為20 μL，片段大小為352 bp。使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.3 磁共振成像技術(shù)(magnetic resonance imaging，MRI)

注：A，心肌組織特異性Isca1敲除大鼠基因型鑒定。B，心肌組織特異性Isca1敲除大鼠敲除效率鑒定。圖1 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠基因型及敲除效率鑒定Note. A. Genotyping identification of Isca1 myocardial conditional knockout rats. B. Identification of knockout efficiency of Isca1 myocardial conditional knockout rats.Figure 1 Genotyping and knockout efficiency of Isca1 myocardial conditional knockout rats

掃描前采用1.5%～2%異戊烷和氧氣氣體對(duì)大鼠進(jìn)行吸入麻醉。當(dāng)大鼠完全麻醉后，將大鼠俯臥位固定于掃描床上，采用體線圈發(fā)射和采集數(shù)據(jù)，并且使大鼠胸部對(duì)準(zhǔn)線圈中心。利用生理參數(shù)監(jiān)護(hù)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控大鼠的呼吸和心電圖(EGG)，并且利用呼吸、EGG門控觸發(fā)采集信號(hào)。同時(shí)利用熱風(fēng)使動(dòng)物體溫保持(37 ± 1)℃。利用Varian 7.0 T/160 mm磁共振儀進(jìn)行心臟電影(CINE)掃描，采集MRI信號(hào)，獲取大鼠四腔心圖像[12]。

1.2.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，H&E)染色

H&E染色包括取材與固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固等操作。具體步驟為：2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔迅速取出心臟，置于在生理鹽水除血后投入4%甲醛中固定48 h；脫水劑脫水后的組織經(jīng)智能石蠟包埋機(jī)包埋制成蠟塊，推拉式切片機(jī)常規(guī)切片(切片厚度4 μm)，恒溫石蠟烤箱烤干后入全自動(dòng)染色機(jī)染色，全自動(dòng)封片機(jī)封片。

1.2.5 透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)觀察

2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔取出心臟，摘取心肌組織固定于2.5%戊二醛(使用0.2 M磷酸緩沖液配制，pH=7.4)固定液中，1%鋨酸后固定1 h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋。乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下觀察，數(shù)碼相機(jī)拍攝圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠基因型及敲除效率分析

繁育實(shí)驗(yàn)所需心肌組織特異性Isca1敲除大鼠，剪新出生大鼠腳趾，提取鼠尾基因組和心臟組織DNA，用PCR技術(shù)進(jìn)行大鼠基因型鑒定和敲除效率分析。同時(shí)具備Isca1Flox純合與攜帶Cre基因的大鼠用于進(jìn)一步研究(7#大鼠，簡(jiǎn)稱為CKO大鼠)，同窩陰性(6#，簡(jiǎn)稱WT)作為對(duì)照(圖1A)。

獲取7.5 d CKO大鼠心臟組織，提取DNA，同日齡的WT大鼠心臟組織DNA作為對(duì)照。用PCR檢測(cè)Cre的敲除效率，使用Image J灰度測(cè)量軟件對(duì)殘留的Isca1FloxPCR帶與基因敲除帶進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，心臟特異敲除效率大于78%(圖1B)。

2.2 0.5 d及2.5 d大鼠核磁共振分析

CKO大鼠在8～10 d全部死于心衰，為了明確心臟功能異常發(fā)生的的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)0.5 d和2.5 d的CKO和WT大鼠進(jìn)行了心臟結(jié)構(gòu)MRI影像分析。使用異氟烷將大鼠麻醉后，將大鼠俯臥位固定于掃描床上，胸部對(duì)準(zhǔn)線圈中心，采集MRI信號(hào)，獲取大鼠四腔心圖像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與野生型相比，0.5 d CKO大鼠心臟未見顯著異常，而2.5 d CKO大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心臟右室擴(kuò)張趨勢(shì)(圖2，n=3)，說明CKO心臟結(jié)構(gòu)異常出現(xiàn)在2.5 d左右。

圖2 2.5 d及0.5 d大鼠核磁共振分析Figure 2 MRI analysis of the 2.5 d and 0.5 d rats

2.3 2.5 d大鼠病理學(xué)分析

取2.5 d CKO和WT大鼠的心臟組織，進(jìn)行常規(guī)固定和制作石蠟切片，并進(jìn)行H&E染色分析。結(jié)果顯示，與野生型相比，CKO大鼠心肌纖維排列不齊，出現(xiàn)排列紊亂，無層次或極向(圖3A，n=3)。

取2.5 d CKO左心室 2 mm × 2 mm大小組織，投入電鏡專用固定液，并完成后續(xù)透射電鏡觀察，同日齡對(duì)應(yīng)部位的心臟組織作為對(duì)照。結(jié)果顯示，與野生型相比，敲除大鼠心肌細(xì)胞部分心肌纖維出現(xiàn)溶解斷裂，肌節(jié)和Z線模糊，出現(xiàn)肌膜損傷，線粒體嵴斷裂，腫脹明顯(圖3B，n=3)。

注：A. H&E染色結(jié)果(×1200)； B. 透射電鏡結(jié)果(×20 000)。圖3 2.5 d大鼠病理學(xué)分析Note. A. Histological changes.H&E staining (×1200). B. Transmission electron microscopic results (×20 000).Figure 3 Pathological analysis of myocardial tissues of the 2.5 d rats

3 討論

鐵硫簇是線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等組成蛋白的重要組成部分和發(fā)揮功能的必須成分[13]。目前研究認(rèn)為，鐵硫簇形成過程中需要大量蛋白的共同作用，包括NFS1(nitrogen fixation 1 homolog)[14]結(jié)合主要支架蛋白ISCU及調(diào)節(jié)蛋白FXN(frataxin)、ISD11[13]并提供S、FXN控制Fe的進(jìn)入，并且在ISCU(iron-sulfur cluster assembly enzyme)上形成初級(jí)鐵硫簇；初級(jí)鐵硫簇隨后通過專有的伴侶-結(jié)合伴侶系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到GLRX5(glutaredoxin 5)；Fe-S簇直接插入到線粒體[2Fe-2S]或通過ISCA1、ISCA2(iron-sulfur cluster assembly 2)、IBA57等特定載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到[4Fe-4S]中；NFU1、BOLA3(bolA family member 3)和NUBPL(nucleotide binding protein like)等載體蛋白將其轉(zhuǎn)移至順烏頭酸酶、琥珀酸脫氫酶，繼而發(fā)揮生物學(xué)功能[15]。臨床發(fā)現(xiàn)，鐵硫簇組裝異?？梢鸲喾N疾病的發(fā)生發(fā)展，并且很多基因缺陷造成的疾病發(fā)病較早，如基因IBA57和NFU1的缺陷均導(dǎo)致嬰兒早期死亡，表現(xiàn)為肌張力減退、呼吸功能不全、腦畸形等癥狀[4, 6]，BOLA3基因異常造成BOLA3型多重線粒體功能障礙綜合征，主要發(fā)生在中樞神經(jīng)與心臟，導(dǎo)致胎兒于圍產(chǎn)期死亡[16-17]。

ISCA1作為鐵硫簇生物合成過程中的特定載體，已報(bào)道其在線粒體Fe4S4成熟過程中扮演著不可或缺的角色[10, 18]，但是Isca1與心血管疾病關(guān)系的研究基本空白。本文利用本實(shí)驗(yàn)室已有的心肌組織特異性Isca1敲除大鼠模型來探究Isca1的缺失是否會(huì)導(dǎo)致心臟于出生后出現(xiàn)異常。首先進(jìn)行大鼠繁育以獲得一定樣本量心肌組織特異性Isca1敲除大鼠，與此同時(shí)鑒定Isca1于心臟中的敲除效率，結(jié)果顯示敲除效率大于78%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。磁共振實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0.5 d WT大鼠相比，0.5 d CKO大鼠心臟暫未發(fā)現(xiàn)顯著異常。與2.5 d WT大鼠相比，2.5 d CKO大鼠心臟右室呈擴(kuò)大趨勢(shì)。有報(bào)道稱特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病(IDCM)以心腔擴(kuò)張，心肌收縮功能降低為特征。IDCM合并右心室收縮功能顯著降低，增加右心室收縮末期壓力，使左、右心室壓力階差降低，導(dǎo)致左心室縮小，三尖瓣反流增加，形成惡性循環(huán)，最終引發(fā)心力衰竭[19-20]，造成嚴(yán)重后果，我們的實(shí)驗(yàn)觀察到，2.5 d大鼠較0.5 d大鼠右心室出現(xiàn)擴(kuò)張，即心臟形態(tài)開始出現(xiàn)異常，因此Isca1缺失是否會(huì)使心臟形態(tài)與功能進(jìn)一步惡化并引發(fā)嚴(yán)重后果仍需進(jìn)一步研究。另外我們?nèi)?.5 d大鼠心臟組織進(jìn)行H&E染色分析和透射電鏡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示顯示肌纖維排列紊亂，并出現(xiàn)溶解斷裂，肌節(jié)和Z線模糊，出現(xiàn)肌膜損傷，線粒體嵴斷裂，腫脹明顯，提示線粒體異常，線粒體功能可能出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致能量代謝出現(xiàn)障礙，影響正常生命活動(dòng)，最終引發(fā)心衰。

綜上所述，ISCA1作為鐵硫簇生物合成過程中的特定載體，其基因的敲除造成新生大鼠心臟結(jié)構(gòu)異常和功能障礙，對(duì)正常生命活動(dòng)造成不良影響。本研究為心血管疾病相關(guān)基因研究工作提供了新的線索，Isca1對(duì)心臟及其他高耗能器官的影響需進(jìn)一步研究。