Nisin、ε-聚賴氨酸和溫度對枯草芽孢桿菌失活動(dòng)力學(xué)的影響

郭全友，劉玲,李保國，姜朝軍

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海，200090) 2(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，極易產(chǎn)生芽孢，同時(shí)是食品發(fā)酵過程中的常見污染菌，并可能導(dǎo)致人類食源性疾病[1]。熟制水產(chǎn)品是以水生動(dòng)物為原料，經(jīng)相應(yīng)工藝加工熟化后制成的風(fēng)味制品。熟制水產(chǎn)品具有營養(yǎng)豐富、味道鮮美，攜帶方便和開袋即食等特點(diǎn)，日益受到消費(fèi)者的青睞。水產(chǎn)原料經(jīng)預(yù)處理、蒸、煮、烘烤和油炸等熟化后，在冷鏈或常溫流通過程中，產(chǎn)品極易腐敗變質(zhì)，其中微生物作用是導(dǎo)致腐敗的主要因素。在沙丁魚、海蜇和鮑汁等[2-4]熟制水產(chǎn)品中，枯草芽孢桿菌和乳鏈球菌等是導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌。如何安全有效殺滅枯草芽孢桿菌及芽孢是保證食品安全的一個(gè)重要問題[5]。對延長熟制水產(chǎn)品的貨架期具有重要作用。

傳統(tǒng)熱殺菌(如高溫高壓)法易對熟制水產(chǎn)品的風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生不良影響，非熱殺菌技術(shù)如超高壓殺菌[6]、脈沖電場殺菌[1]、生物殺菌[7]及酸性電解水殺菌[8]等能有效保持產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)和營養(yǎng)等。生物殺菌法是利用生物代謝產(chǎn)物來抑制或殺滅微生物，與其他非熱殺菌技術(shù)相比，殺菌強(qiáng)度溫和，能更大程度保持原有的色澤、營養(yǎng)和風(fēng)味等。同時(shí)，化學(xué)防腐劑的持續(xù)廣泛使用可能造成嚴(yán)重的健康問題，每日高攝入量可能導(dǎo)致人體對食品腐敗菌和致病菌產(chǎn)生抗性[9]。生物保鮮劑具有天然、高效和安全無毒的特性，在消化道內(nèi)極易降解，對人體消化道菌群活性無影響等[7]，種類主要有ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、溶菌酶、茶多酚和殼聚糖等。ε-聚賴氨酸是種常用食品保鮮劑[10]，對革蘭氏陽性菌、酵母菌和霉菌具有廣譜抑制作用，尤其對耐熱性芽孢桿菌和某些病毒具有較強(qiáng)抑制作用[11]，熱穩(wěn)定性高，且對人體無毒性或毒性較低。乳酸鏈球菌肽(Nisin)具有耐熱，易在消化系統(tǒng)中消化，對廣譜革蘭氏陽性菌具有抑制作用，作為世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國食藥監(jiān)管局(FDA)批準(zhǔn)的天然食品添加劑已在50多個(gè)國家使用[12-13]。Nisin能有效殺滅處于萌發(fā)狀態(tài)的枯草芽孢桿菌[14]，具有抑制孢子生長及溶解營養(yǎng)細(xì)胞的作用，ε-聚賴氨酸和Nisin對枯草芽孢桿菌具有協(xié)同抑菌效應(yīng)[9,15]。

針對食品中重要的有害芽孢桿菌(如蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)，研究何種殺滅和抑制手段，來有效控制菌體生長和殺滅孢子，是當(dāng)前研究的2個(gè)重要方向。RAO等采用傳統(tǒng)熱殺菌[16]、微波殺菌[17]和高壓CO2[18]等高強(qiáng)度殺菌手段或聯(lián)合生物保鮮劑(如Nisin等)可有效殺滅芽孢桿菌孢子；CHI等采用多種生物保鮮劑等溫和手段來協(xié)同抑制芽孢桿菌的生長和失活等[9,15,19]。在外界抑菌因子或殺菌等作用下，微生物等生長極易受到抑制甚至失活，失活模型可預(yù)測微生物特定條件的死亡狀況。微生物失活模型包括Weibull、Log-logistic、修正Gompertz和Biphasic模型等[20]。研究顯示,Weibull模型和Log-logistic模型可較好擬合非熱失活曲線[20-23]，國內(nèi)外關(guān)于腐敗菌的生長、失活模型均有大量報(bào)道[12-13]，其中對枯草芽孢桿菌的研究多集中于生長模型，而生物保鮮劑作用下的失活模型相對較少[24-25]。

在前期對熟制對蝦蝦仁常溫貯藏下的貨架期和腐敗菌特性、微波殺滅地衣芽孢桿菌孢子特性及效果的研究基礎(chǔ)上[17,26]，本文以分離自熟制對蝦蝦仁貨架期終點(diǎn)的枯草芽孢桿菌為對象，采用Nisin、ε-聚賴氨酸和溫度等溫和抑菌手段，運(yùn)用線性模型、Weibull模型和Log-logistic模型擬合失活動(dòng)力學(xué)曲線，采用Af、Bf、RMSE、R2對模型擬合優(yōu)度進(jìn)行評價(jià)，并對失活動(dòng)力學(xué)預(yù)測值和實(shí)測值進(jìn)行比較，旨在為優(yōu)化靶向生物殺菌和延長水產(chǎn)品貨架期等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

真空包裝熟制對蝦蝦仁(采購于寧德市某水產(chǎn)公司)貨架期終點(diǎn)時(shí)分離純化出優(yōu)勢菌株，經(jīng)MIDI細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(Microbial ID Inc.,美國)、BIOLOG細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(Biolog公司，美國)、16S rRNA測序(KU570452.1)[17,26]鑒定為枯草芽孢桿菌，凍干，4 ℃貯藏，待用。

1.2 原料與試劑

乳酸鏈球菌素,浙江新銀象生物工程有限公司;ε-聚賴氨酸,鄭州博研生物科技有限公司;

營養(yǎng)肉湯：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃下高壓滅菌 15 min，備用。

營養(yǎng)瓊脂：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL(加固體瓊脂粉 20 g)，調(diào)pH值7.0，121 ℃下高壓滅菌15 min，備用。

NaCl、冰乙酸(AR)及其他主要試劑，上海市國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺(SW-CJ-1FB)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低溫培養(yǎng)箱(MIR-153)，日本三洋公司；反壓蒸煮消毒鍋(ZM-100)，廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-200H)，上海智城分析儀器制造有限公司；pH測定儀(HI 2216 pH/ORP/ISE Meter)，北京哈納科學(xué)儀器科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液制備

菌株活化：把凍干枯草芽孢桿菌接種在營養(yǎng)肉湯中，150 r/min振蕩，37 ℃培養(yǎng) 8 h，增殖至對數(shù)初期，此時(shí)菌數(shù)約 105CFU/mL。

擴(kuò)大培養(yǎng)：將 0.5%活化好的菌種接種至 100 mL TSB增菌液中，30 ℃靜止培養(yǎng)(約12 h)至對數(shù)生長后期，菌數(shù)約109CFU/mL，獲得原菌液。

將原菌液接種至營養(yǎng)肉湯中，初始接種量約107CFU/mL。按照GB 4789.2—2016進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。單因素試驗(yàn)均做 3個(gè)平行，重復(fù)2次。

1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

參考GB 2760—2014標(biāo)準(zhǔn)，Nisin在熟制水產(chǎn)品中限量≤0.5 g/kg，ε-聚賴氨酸在熟肉制品中限量≤ 0.25 g/kg。ε-聚賴氨酸及Nisin溶液梯度皆設(shè)置為0.031 3、0.062 5和0.125 mg/mL，溶于營養(yǎng)肉湯中。結(jié)合2種生物保鮮劑的特點(diǎn)，設(shè)定菌液pH值為5。

將達(dá)到穩(wěn)定期的枯草芽孢桿菌菌懸液分別與Nisin或ε-聚賴氨酸溶液按1∶1混合，空白對照組不添加Nisin/ε-聚賴氨酸，只加營養(yǎng)肉湯(pH=5)，稀釋至約105～106CFU/mL，在25、37和45 ℃培養(yǎng)，在1、5、15、30、90和180 min取樣，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。失活效應(yīng)以lg(LD)表示，如公式(1)所示：

lg(LD) = lgN0-lgNi

(1)

式中：LD,失活量；Ni,培養(yǎng)i(i=1、5、15、30、90和180)min后枯草芽孢桿菌的菌落數(shù),CFU/mL；N0,培養(yǎng)0 h時(shí)的菌落數(shù),CFU/mL。

1.4.3 模型的選擇

一級動(dòng)力學(xué)模型，線性模型(Linear)描述了Nisin、ε-聚賴氨酸和溫度對枯草芽孢桿菌的失活數(shù)量與處理時(shí)間的線性關(guān)系[27]，見公式(2)。

(2)

式中：N0和N分別是初始和經(jīng)處理特定時(shí)間(t，min) 后微生物或芽孢的數(shù)量，CFU/mL；D表示使90%的枯草芽孢桿菌死亡所需的時(shí)間，min。

Weibull模型：該失活曲線表述了各種失活因子的累積效應(yīng)，描述營養(yǎng)體和細(xì)胞具有不同的耐受性[21,28]，見公式(3)。

(3)

式中：N0和N分別是初始和經(jīng)處理特定時(shí)間(t，min) 后微生物或芽孢的數(shù)量，CFU/mL；b與n分別是尺度參數(shù)和形狀參數(shù)。當(dāng)n<1，Weibull分布為一凹面向上的曲線；n>1，曲線凹面向下；n=1時(shí)為一條直線。

Log-logistic模型：該模式用以擬合微生物非熱失活的非線性模型[29]，見式(4)。

(4)

式中：α為上漸近線，lg CFU/g；ω為下漸近線，lg CFU/g；σ為失活曲線最大斜率；τ表示失活曲線大到最大斜率時(shí)數(shù)量級時(shí)間，lg(t)，τ決定曲線位置；t為處理時(shí)間，min。

1.4.4 擬合優(yōu)度評價(jià)

(5)

(6)

(7)

式中：yobs為實(shí)測值；ycal為預(yù)測值；n為實(shí)測值個(gè)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010 進(jìn)行均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，Origin 9.0軟件(美國OriginLab公司)動(dòng)力學(xué)模型擬合并作圖，SPSS17.0軟件(美國IBM公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析(analysis of variance，ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nisin及ε-聚賴氨酸對枯草芽孢桿菌失活情況的影響

由圖1可知，25 ℃下，在180 min終點(diǎn)時(shí)隨Nisin的濃度升高，枯草芽孢桿菌的失活量從4.29 lgCFU/mL增加至4.39 lgCFU/mL；隨ε-聚賴氨酸的濃度升高，失活量從5.12 lgCFU/mL增加至6.35 lgCFU/mL。37 ℃下，在180 min終點(diǎn)時(shí)隨Nisin的濃度升高，枯草芽孢桿菌的失活量從5.43 lgCFU/mL增加至6.70 lgCFU/mL；隨ε-聚賴氨酸的濃度升高，失活量達(dá)6.70 lgCFU/mL。45 ℃下，在180 min終點(diǎn)時(shí)隨Nisin的濃度升高，枯草芽孢桿菌的失活量從2.06 lgCFU/mL增加至2.47 lgCFU/mL；隨ε-聚賴氨酸的濃度升高，失活量從4.00 lgCFU/mL增加至4.5 lgCFU/mL。同時(shí)，Nisin及ε-聚賴氨酸溶液在微酸環(huán)境下抑菌活性更高，在選用微酸(pH=5)條件下，對照組在25、37及45 ℃時(shí)180 min內(nèi)也呈現(xiàn)一定失活量，微酸環(huán)境可能是導(dǎo)致枯草芽孢桿菌菌數(shù)下降的主要原因。雖然微酸環(huán)境對枯草芽孢桿菌的生長有一定抑制作用，但很難有失活效果。45 ℃時(shí)，ε-聚賴氨酸組枯草芽孢桿菌的失活量高于Nisin組，該溫度下，Nisin的失活效果不顯著。由圖1可知，37 ℃時(shí)，除在質(zhì)量濃度為0.031 3 mg/mL外，兩者失活量差異不顯著；25和45 ℃時(shí)，ε-聚賴氨酸處理180 min后的枯草芽孢桿菌失活量>Nisin組失活量。pH 5時(shí)，可能是2種保鮮劑與pH值產(chǎn)生相互作用所導(dǎo)致的，研究指出Nisin在pH<4時(shí)穩(wěn)定性最強(qiáng)，4

a-25 ℃+(0～0.125)mg/mL Nisin/ε-聚賴氨酸+180min；b-37 ℃+(0～0.125)mg/mL Nisin/ε-聚賴氨酸+180minc-45 ℃+(0～0.125)mg/mL Nisin/ε-聚賴氨酸；“—”空白對照線：各溫度180 min終點(diǎn)值圖1 不同溫度下Nisin和ε-聚賴氨酸對枯草芽孢桿菌失活情況的影響Fig.1 Effects of Nisin and ε-polylysine on inactivation of Bacillus subtilis at different temperature

2.2 ε-聚賴氨酸和Nisin失活動(dòng)力學(xué)曲線分析

表1 三種動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線參數(shù)及統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 1 Three dynamic models fit curve parameters and statistical parameters

a-25 ℃+(0～0.125)mg/mL Nisin; b-25℃+(0～0.125)mg/mL ε-聚賴氨酸；c-37 ℃+(0～0.125)mg/mL Nisin；d-37℃+(0～0.125)mg/mL ε-聚賴氨酸；e-45 ℃+(0～0.125)mg/mL Nisin；f-45℃+(0～0.125)mg/mL ε-聚賴氨酸圖2 Weibull模型和Log-logistic模型在不同條件下失活枯草芽孢桿菌的動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig.2 Death curves of Bacillus subtilis in nutrient broth at different conditions

CHEN等[21]結(jié)合對牛乳中單增李斯特菌的失活動(dòng)力學(xué)研究時(shí)選擇了Linear模型、Weibull模型和Log-logistic模型對失活曲線進(jìn)行擬合，最終選擇Log-logistic方程進(jìn)行描述。COLLADO和盧蓉蓉等[25,28]研究表明，Weibull模型可較好描述芽孢桿菌失活動(dòng)力學(xué)過程，EVELYN等[33]用Log-logistic模型較好描述牛肉漿中芽孢桿菌孢子失活情況。Weibull模型和Log-logistic模型的R2平均值分別為0.970和0.992，表明兩模型均能較好描述Nisin及ε-聚賴氨酸對枯草芽孢桿菌失活效應(yīng)，且擬合度相差不多。在模型的選擇過程中，模型的擬合優(yōu)度是根據(jù)參數(shù)值來判斷，所以排除線性模型用于擬合枯草芽孢桿菌的失活動(dòng)力學(xué)模型。

2.3 模型擬合優(yōu)度評價(jià)

采用Af、Bf、RMSE和R2等參數(shù)比較Weibull模型和Log-logistic模型下枯草芽孢桿菌失活曲線的擬合優(yōu)度。由表2可知，Weibull模型Af、Bf、RMSE和R2均值分別為1.02～1.18、0.94～1.08、0.080～0.740和0.963，而Log-logistic的Af、Bf、RMSE和R2均值分別為1.01～1.09、0.98～1.02、0.04～0.26和0.991。表明，Log-logistic模型預(yù)測的平均精度更高，離散程度較低，其擬合優(yōu)度優(yōu)于Weibull模型，與盧蓉蓉等[34]研究所示W(wǎng)eibull模型R2(均值=0.94)和Log-logistic模型R2(0.980～0.998)較接近。COLLADO等[25]運(yùn)用Weibull模型擬合4～20℃下芽孢桿菌孢子失活過程；EVELYN等[33]研究了Log-logistic模型描述超聲波結(jié)合熱處理下，2種芽孢桿菌失活過程，說明2種模型均可較好模擬殺菌過程，也可預(yù)測不同處理?xiàng)l件下的殺菌效果。

表2 Weibull模型與Log-logistic模型評價(jià)參數(shù)Table 2 Weibull model and Log-logistic model evaluation parameters

為考察2種模型是否具備預(yù)測失活效果的功能，比較Weibull模型與Log-logistic模型回歸方程計(jì)算的預(yù)測值與實(shí)測值的接近程度，基于37℃時(shí)0.125 mg/mL ε-聚賴氨酸和Nisin失活效果最優(yōu)，選取該2組微生物殘存預(yù)測值與實(shí)測值進(jìn)行比較，圖3所示，Log-logistic模型(R2=0.994～0.996)擬合優(yōu)度優(yōu)于Weibull模型(R2=0.912～0.994)，均可較好預(yù)測失活效應(yīng)。這與高芳等[27]建立超高壓協(xié)同溫度處理對綠色魏斯式菌的失活動(dòng)力學(xué)中，也選擇了Linear模型、Weibull模型和Logistic模型處理模型擬合結(jié)果，最終Logistic模型作為最適擬合模型結(jié)果相似。

2.4 模型的驗(yàn)證

通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到枯草芽孢桿菌的減少量即實(shí)測值，隨機(jī)挑選兩組條件(37 ℃、ρ(Nisin)=0.100 mg/mL、ρ(ε-聚賴氨酸)=0.050 mg/mL和30 ℃、ρ(Nisin)=0.150 mg/mL、ρ(ε-聚賴氨酸)=0.125 mg/mL作為試驗(yàn)條件，將各試驗(yàn)條件分別帶入對應(yīng)的模型公式(4)、(5)、(6)中，得到預(yù)測值。根據(jù)實(shí)測值和預(yù)測值便可計(jì)算得到模型的Af、Bf、RMSE值。從表3可知，除線性模型外，Weibull模型、Log-logistic模型的偏差因子Bf值分別在 0.98～1.08，說明這些模型較可靠，能有效評價(jià)蝦源枯草芽孢桿菌的失活趨勢。

a-37 ℃+0.125 mg/mL ε-聚賴氨酸;b-37 ℃+0.125 mg/mL Nisin圖3 Weibull模型與log-logistic模型預(yù)測值和實(shí)測值的相關(guān)性Fig.3 Correlation between predicted and measured values of weibull model and log-logistic model

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)的線性模型、Weibull模型、Log-logistic模型的Af、Bf、RMSE值Table 3 Af, Bf, RMSE values of the linear model, the Weibull model, and the log-logistic model of the demonstration test

條件AfBfRMSELinearWeibulllog-logisticLinearWeibulllog-logisticLinearWeibulllog-logistic37 ℃,ρ(Nisin)=0.100 mg/mLρ(ε-PL)=0.050 mg/mL0.711.061.011.321.080.980.540.110.0230 ℃,ρ(Nisin)=0.150 mg/mLρ(ε-PL)=0.125 mg/mL0.631.020.980.781.051.030.420.080.06

3 結(jié)論

(1)在25、37和45 ℃時(shí)，蝦源枯草芽孢桿菌在0.0313～0.125 mg/mL Nisin溶液及ε-聚賴氨酸溶液抗菌作用下，15～180 min可顯著降低其菌數(shù)(P<0.05)。溫度越趨向于37 ℃，2種生物保鮮劑濃度越高，失活效果越好。

(2)經(jīng)驗(yàn)證，線性模型不能很好地?cái)M合失活動(dòng)力學(xué)曲線，Weibull模型和Log-logistic模型的R2平均值分別為0.970和0.992，表明2種模型均能很好擬合其失活過程；Weibull模型Af、Bf、RMSE和R2均值分別為1.02～1.18、0.94～1.08、0.080～0.740和0.963，而Log-logistic的Af、Bf、RMSE和R2均值分別為1.01～1.09、0.98～1.02、0.04～0.26和0.991。表明Log-logistic模型預(yù)測的平均精度更高，離散程度較低，其擬合優(yōu)度優(yōu)于Weibull模型。進(jìn)一步通過比較2種模型回歸方程預(yù)測值與實(shí)測值的接近程度，得出Log-logistic模型(R2>0.99)擬合優(yōu)度優(yōu)于Weibull模型(R2>0.96)，應(yīng)用Logistic模型可以較好地體現(xiàn)不同保鮮劑結(jié)合溫度處理下枯草芽孢桿菌在不同基質(zhì)中的死亡情況，也很好地預(yù)測處理ε-聚賴氨酸和Nisin協(xié)同溫度在蝦源枯草芽孢桿菌的死亡動(dòng)態(tài)變化，這為延長水產(chǎn)品貨架期及制定產(chǎn)品質(zhì)量安全控制方案提供參考依據(jù)。