雞安卡拉病卵黃抗體的制備與應(yīng)用研究

李心海 遲 蘭 張林吉 （徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇 徐州 221151)

2015年6月以來，河南、山東、河北、遼寧、吉林、安徽、湖北等省大多數(shù)地區(qū)暴發(fā)了雞安卡拉病，該病以雞心包積液和肝炎為主要特征[1]。該病最早于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)一個肉雞場發(fā)生暴發(fā)性流行，因此通常稱作雞安卡拉病。目前該病在世界多個國家均有報道?！靶陌e液綜合征”即安卡拉病毒病就是由Ⅰ群禽腺病毒中特定血清型感染引起的[2]。30日齡雞易感，隨著日齡的增長，雞的免疫力逐漸增強，死亡率降低，病程1～2周，死亡率最高可達70%，可給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失。

雞安卡拉病是由病毒引起，目前，我國并沒有農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的疫苗，抗生素對該病療效不大，沒有特效藥物可進行有效防控。當(dāng)疾病發(fā)生時，會給養(yǎng)殖戶造成嚴重損失。因此，很有必要開發(fā)出高效特異性的藥物進行防控。卵黃抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病防治，且收到良好的應(yīng)用效果?；瘜W(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，易于運輸和保存；易于商品化生產(chǎn)，價格低廉，效價比高。筆者利用在徐州地區(qū)分離到的1株血清4型Ⅰ群禽腺病毒制備油乳劑滅活疫苗，并制備高免卵黃抗體，經(jīng)過實驗室試驗證明，高免卵黃抗體可以有效防控雞安卡拉病的發(fā)生和流行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 在徐州地區(qū)某發(fā)生疫情的養(yǎng)雞場采集雞心、肝等器官，于實驗室分離鑒定一株血清4型I群禽腺病毒并保存。

1.1.2 試驗動物 30日齡健康肉仔雞和180日齡健康開產(chǎn)蛋雞均購自無血清4型I群禽腺病毒感染史的雞群。

1.1.3 主要試劑 白油、乳化劑Span-80、乳化劑Tween-80等試劑均購自化學(xué)試劑商店。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖 7～10日齡的SPF雞胚經(jīng)卵黃囊途徑接種0.2ml，置于37℃孵化，每天觀察。將24h內(nèi)死亡的雞胚直接淘汰，收獲24h后死亡的雞胚尿囊液，每胚可收取5～10ml的尿囊液。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 滅活疫苗的制備 （1）滅活：-20℃保存的尿囊液加入甲醛溶液，混合攪勻，使甲醛溶液的濃度為0.1%。置37℃滅活16h，每隔3～4h振搖1次，即得滅活抗原。（2）疫苗制備：白油與Span-80按比例混勻成油相。滅活抗原與Tween-80按比例混勻成水相。將3份油相與2份水相混勻并乳化成油包水型血清4型I群禽腺病毒滅活疫苗。

1.2.3 免疫方法 選用180日齡健康產(chǎn)蛋雞30只，體重2kg左右，按正常飼養(yǎng)要求進行飼養(yǎng)。對雞皮下及肌肉多個部位注射。第一次免疫劑量為0.2ml/kg，在基礎(chǔ)免疫后的第14d、21d再進行加強免疫，免疫劑量分別為0.4ml/kg、0.8ml/kg。三免后每隔60d再進行免疫，免疫劑量為0.8ml/kg，在腿部肌肉注射。同時選用10只產(chǎn)蛋雞，并于同部位注射相同劑量的滅菌生理鹽水作為對照組。將所產(chǎn)雞蛋收集并作好記錄，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 高免卵黃抗體監(jiān)測 于首次免疫后7、14、21、30、60、120、180d分別收集免疫組和對照組的雞蛋，無菌收集蛋黃，制成高免卵黃抗體。以制備的滅活抗原為檢測抗原，采用瓊脂擴散試驗方法測定免疫組和對照組的卵黃抗體效價。

1.2.5 高免卵黃抗體的制備 （1）收集經(jīng)瓊脂擴散試驗方法測定卵黃抗體效價在6log2以上的雞蛋。先用水清洗蛋殼上的污漬，再用0.1%新潔爾滅溶液浸泡30min。（2）分離蛋黃：將蛋殼表面用酒精棉球擦拭清潔，打開蛋殼，倒出蛋清，取出蛋黃，收集蛋黃放入無菌容器。（3）卵黃勻漿：取990份蛋黃液與10份1 %柳硫汞溶液、加入硫酸丁

胺卡那霉素溶液及無菌生理鹽水，用組織搗碎機以12000r/min勻漿10min，制備成高免卵黃抗體。1.2.6 成品檢驗 按照2016版《中華人民共和國獸藥典》中的方法進行微生物學(xué)檢測、穩(wěn)定性檢測、雞胚接種、安全檢驗。

1.2.7 治療試驗 將100只30日齡健康雞平均分成5組，各組均肌肉注射2.1中制備的病毒液0.5ml，24h后，第一組頸部皮下注射卵黃抗體0ml，第二組頸部皮下注射氟苯尼考溶液1ml，第三組頸部皮下注射環(huán)丙沙星溶液1ml，第四組頸部皮下注射利巴韋林1ml，第五組頸部皮下注射卵黃抗體1ml。隔離觀察，按常規(guī)要求飼養(yǎng)，觀察2周，對每組雞的死亡數(shù)與治愈數(shù)進行統(tǒng)計，分析使用不同藥物對人工感染血清4型I群禽腺病毒仔雞的治療效果。

1.2.8 預(yù)防試驗 將80只未免疫的健康仔雞分成4組，每組20只。第1組注射卵黃抗體1ml，2d后再攻毒；第2組注射卵黃抗體1ml與攻毒同時進行；第3組先攻毒，2d后再注射卵黃抗體1ml；第4組不注射卵黃抗體僅作攻毒對照。

1.2.9 抗體消長規(guī)律試驗 選未免疫30日齡健康雞40只，平均分成2組，第一組每只胸部肌肉注射卵黃抗體0ml，第二組每只胸部肌肉注射卵黃抗體1ml，每2d采血一次檢測血清4型I群禽腺病毒的抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 高免卵黃抗體監(jiān)測結(jié)果 如表1所示，在疫苗免疫后，2周后免疫母雞所產(chǎn)蛋卵黃中血清4型I群禽腺病毒抗體效價超過了4log2，30d后抗體效價超過了6log2，符合采收要求。

2.2 常規(guī)檢驗結(jié)果 （1）微生物學(xué)檢測：將卵黃抗體接種于厭氧肉湯培養(yǎng)基和普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)48h，沒有發(fā)現(xiàn)細菌生長。（2）穩(wěn)定性檢測：取油乳劑滅活苗10ml，經(jīng)3000r/min離心20min后，油乳劑外觀沒有出現(xiàn)分層、破乳等變化。（3）雞胚接種：用生理鹽水將卵黃抗體10倍稀釋，經(jīng)卵黃囊途經(jīng)接種7日齡SPF雞胚10枚，每枚0.2ml，置于37℃恒溫箱孵育7d，24h內(nèi)沒有雞胚死亡。（4）安全檢驗：取30日齡健康雞10只，均胸部肌肉注射卵黃抗體2ml，飼養(yǎng)14d，所有試驗雞均健康。

表1 免疫雞卵黃抗體效價測定結(jié)果 (log2)

圖1 免疫雞卵黃抗體效價測定

2.3 治療試驗效果 如表2所示，對照組的20只肉仔雞全部死亡，注射抗菌及抗病毒藥物1.0ml的20只肉仔雞分別死亡19、20、19，注射卵黃抗體肉仔雞無死亡，治愈率分別為0、0、0、0和100%。

表2 不同劑量卵黃抗體治療效果 (ml、只)

2.4 預(yù)防試驗 如表3所示，第一組注射卵黃抗體1ml，2d后再攻毒，20只雞觀察10d，精神狀態(tài)良好，預(yù)防保護率100%。第二組注射卵黃抗體1ml與攻毒同時進行，20只雞在觀察期間，健康良好，預(yù)防保護率100%。第三組先攻毒，2d后再注射卵黃抗體1ml，20只雞在觀察期間，有6只死亡，出現(xiàn)精神沉郁，拉黃綠糞便，呼吸困難等癥狀，其余雞只健康。治療保護率70%。第4組不注射卵黃抗體僅作攻毒對照，20只雞在觀察期間，全部發(fā)病死亡，出現(xiàn)精神沉郁，拉黃綠糞便，呼吸困難等癥狀，剖檢可見心包積液，肝臟腫大。發(fā)病率100%，死亡率100%。

2.5 抗體消長試驗結(jié)果 如表4所示，雞只注射1ml卵黃抗體后，即可獲得較強的免疫保護。隨著日齡的增加，雞只體內(nèi)抗體效價逐漸降低。至第10d時，抗體效價為2.7log2，仍可對雞只產(chǎn)生有效的免疫保護。

表3 卵黃抗體預(yù)防試驗結(jié)果

表4 抗體消長試驗結(jié)果(平均值)

圖2 抗體消長試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果證明：抗生素和抗病毒藥治療禽腺病毒病幾乎無效，高免卵黃抗體治療禽腺病毒病，治愈率達100%，預(yù)防保護率達100%，可有效保護雞只10d左右。高免卵黃抗體對禽腺病毒病有良好的預(yù)防效果，在生產(chǎn)過程中并不能確定雞群感染血清4型Ⅰ群禽腺病毒的具體時間，因此，應(yīng)及早預(yù)防。在禽腺病毒病流行時可以連續(xù)兩次注射高免卵黃抗體進行緊急治療，也可用于預(yù)防，可以有效減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失，是目前比較理想的防控血清4型I群禽腺病毒的生物制品。