不同腌制方法對(duì)山葵酸菜中亞硝酸鹽含量的影響

王躍華，王宗兵，許芮菡，劉洪明，戴靜，李亞林

(成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，成都 610106)

腌菜是我國(guó)傳統(tǒng)的蔬菜制品，分為非發(fā)酵蔬菜制品和發(fā)酵蔬菜制品。非發(fā)酵蔬菜制品腌制過(guò)程中用鹽量較大，微生物發(fā)酵作用不明顯。發(fā)酵蔬菜制品在腌制時(shí)用鹽量較少，腌漬過(guò)程中有旺盛的乳酸發(fā)酵作用。這類產(chǎn)品一般都具有明顯的酸味，主要包括泡菜和酸菜等[1，2]。

中國(guó)腌菜擁有廣闊的國(guó)際市場(chǎng)，其中以四川的腌制蔬菜最為出名，但在國(guó)際市場(chǎng)上卻不如韓國(guó)與日本。為滿足人們不同的消費(fèi)嗜好，增強(qiáng)我國(guó)酸菜在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，開(kāi)展腌菜質(zhì)量研究發(fā)展十分重要。然而腌菜中亞硝酸鹽含量超標(biāo)一直都是廣受消費(fèi)者關(guān)注的問(wèn)題，我國(guó)食品衛(wèi)生法規(guī)定了腌制品中亞硝酸鹽含量應(yīng)小于30 mg/kg[3，4]。

研究表明，蔬菜中亞硝酸鹽的由來(lái)，主要是高等植物在生長(zhǎng)過(guò)程中要利用土壤中的硝酸鹽生成菌轉(zhuǎn)化硝酸鹽來(lái)合成自身生長(zhǎng)必需的蛋白質(zhì)，當(dāng)氣候干旱、光照不足、氮肥量大時(shí)，造成植物代謝混亂，而硝酸鹽因無(wú)法有效利用而堆積于植物體內(nèi)，在硝酸還原酶的作用下生成亞硝酸鹽。當(dāng)人體和食物中的亞硝酸鹽和胺類或酰胺同時(shí)存在時(shí)，就會(huì)形成亞硝胺，亞硝胺是一級(jí)化學(xué)致癌物質(zhì)，會(huì)誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。因此，阻斷亞硝酸鹽合成或消除亞硝胺的前體是防治癌病的有效途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)利用不同的傳統(tǒng)腌制方法組合腌制酸菜，并采用鹽酸萘乙二胺比色法[5-7]測(cè)定了山葵酸菜從腌制開(kāi)始到成熟的過(guò)程中亞硝酸鹽的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

制作酸菜原料：新鮮山葵葉(采自廣元山葵種植基地)；老酸菜(連續(xù)發(fā)酵1年的山葵老酸菜)、酸菜水(連續(xù)發(fā)酵1年的山葵酸菜水)及普通泡菜水，均由廣元市璽府生物科技有限公司提供；面水為10 g面粉溶于250 g水中煮開(kāi)即可。

1.2 儀器與試劑

玻璃罐(500 mL)、HH-4S水浴鍋、FA1204B/0.0001 g電子分析天平、UV-2201型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；高速組織攪拌器、去離子水、各種試劑參照國(guó)標(biāo)配制，各種藥品均采用分析純(A.R.)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取不同量的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中構(gòu)成不同亞硝酸鹽濃度，加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸2 mL，搖勻靜止3 min，加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺，加水定容至刻度，靜置15 min。于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.61289x+0.01271, r=0.99926，線性范圍為0～1.4 μg/mL。

1.4 樣品的提取及凈化

取適量已腌制的山葵酸菜于粉碎機(jī)中粉碎，稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL燒杯中，加入12.5 mL的飽和硼砂溶液，再用300 mL的70 ℃水將其洗入500 mL容量瓶中，在沸水中水浴加熱15 min后冷至室溫。

冷卻至室溫后，加入5 mL亞鐵氰化鉀，搖勻，再加5 mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)。加去離子水至刻度，搖勻，倒入500 mL燒杯中，放置30 min后，上清液用濾紙過(guò)濾，棄去初液30 mL，濾液備用測(cè)量。

1.5 樣品提取液的測(cè)量

取提取液40 mL于比色管中，加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸2 mL，搖勻，靜置3 min。加入2 g/L鹽酸萘乙二胺1 mL，加水定容至刻度，靜置15 min。在波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相應(yīng)濃度及樣品亞硝酸含量。

1.6 山葵酸菜腌制的配方

山葵酸菜腌制的配方見(jiàn)表1。

表1 山葵酸菜腌制配方Table 1 Curing formula of pickled Wasabia japonica g

注：配方中外加輔助發(fā)酵物質(zhì)即代表相應(yīng)腌制方法。

1.7 發(fā)酵母液乳酸菌的測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)給出的計(jì)數(shù)方法，在超潔凈工作臺(tái)中取老酸菜、酸菜水、泡菜水各10.00 g溶于100 mL無(wú)菌生理鹽水中，同時(shí)攪拌20 s使老酸菜上菌體充分溶于無(wú)菌生理鹽水中，取1 mL液體加入到9 mL無(wú)菌生理鹽水中，適當(dāng)稀釋后各選擇3個(gè)合適的梯度稀釋液，分別取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度做2次平行涂布。將MRS固體培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，YPD固體培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂固體培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。最后細(xì)菌計(jì)數(shù)選取平板菌數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行數(shù)目分析計(jì)算，真菌計(jì)數(shù)選取平板菌數(shù)在10～100之間的平板進(jìn)行數(shù)目分析計(jì)算。菌落計(jì)算公式：乳酸菌濃度=(菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 各外加輔助發(fā)酵物質(zhì)乳酸菌含量

老酸菜：4.0 lg(CFU/g)、酸菜水：5.5 lg(CFU/g)、泡菜水：4.8 lg(CFU/g)。

2.2 各外加輔助發(fā)酵物質(zhì)對(duì)酸菜亞硝酸鹽含量的影響

2.2.1 酸菜水和面水對(duì)酸菜亞硝酸鹽含量的影響

分析酸菜腌制過(guò)程中加了酸菜水時(shí)，再加面水對(duì)腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量的影響。

圖1 酸菜水和酸菜水+面水比較圖Fig.1 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water and pickled Chinese cabbage water+flour water

由圖1可知，在腌制酸菜過(guò)程中，無(wú)論是A1還是A2，其亞硝酸鹽峰值均在10 mg/kg以下。在山葵酸菜的腌制過(guò)程中，加酸水其發(fā)酵作用強(qiáng)，使發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量低，再加面水能顯著延遲亞硝峰的出現(xiàn)。原因是A2中面水作為雜菌與乳酸菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，促使發(fā)酵前期雜菌與乳酸菌含量較A1組大，而A1由于無(wú)面水促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，其乳酸菌利用其酸性環(huán)境緩慢生長(zhǎng)，雖然前期雜菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽被積累，但雜菌數(shù)量與A2相比較少，第4天后乳酸菌數(shù)量增大到足夠量，其能迅速降解前期積累的亞硝酸鹽。而A2短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較大量雜菌與乳酸菌，乳酸菌利用其酸性環(huán)境與菌種優(yōu)勢(shì)的能力較A1小，雜菌產(chǎn)生較大量亞硝酸鹽，同時(shí)乳酸菌也消除相應(yīng)亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的產(chǎn)生與消除平衡使亞硝酸鹽一直處于較低但依然上升的狀態(tài)，導(dǎo)致A2組較A1組亞硝峰推遲并降低。同時(shí)在腌制后期由于A2含有更多的雜菌，其后期乳酸菌菌種優(yōu)勢(shì)較A1小，亞硝酸鹽消除較A1慢，因此后期亞硝酸鹽量A2>A1。此外加面水實(shí)驗(yàn)組亞硝峰的峰值比不加面水低，原因可能是面水促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，乳酸菌的快速繁殖產(chǎn)生乳酸及乳酸菌自身酶系統(tǒng)降解腌制過(guò)程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽[8]。

2.2.2 酸菜水、面水、老酸菜對(duì)酸菜亞硝酸鹽含量的影響

圖2 酸菜水、酸菜水+面水、老酸菜、老酸菜+面水配對(duì)比較圖Fig.2 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water, pickled Chinese cabbage water+flour water,mature pickled Chinese cabbage,mature pickled Chinese cabbage water+flour water

分析酸菜腌制過(guò)程中加了老酸菜時(shí)，再加面水對(duì)腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量的影響，同時(shí)比較酸菜腌制過(guò)程中加酸菜水與加老酸菜兩種對(duì)應(yīng)腌制方法對(duì)酸菜腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量的影響。

由圖2可知，比較A3與A4，在加了老酸菜的基礎(chǔ)上再加面水的蔬菜腌制過(guò)程中亞硝峰出現(xiàn)比不加面水早，并且總的亞硝酸鹽含量更低。其原因是A3、A4加入的老酸菜中乳酸菌含量較少，為4.0 lg(CFU/g)，而原料中雜菌較多，因此A3、A4乳酸菌菌種優(yōu)勢(shì)小[9]，面水更能促進(jìn)雜菌的生長(zhǎng)，其亞硝酸鹽產(chǎn)量迅速上升，因此前2天A4亞硝酸鹽含量較A3多。在高亞硝酸鹽濃度下，乳酸菌降低亞硝酸鹽作用更加明顯，導(dǎo)致亞硝峰提前。比較A1與A3，A2與A4，在酸菜發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中，加酸菜水比加老酸菜的亞硝酸鹽含量更低，亞硝峰出現(xiàn)明顯延遲，并且加酸菜水實(shí)驗(yàn)組峰值僅為不加酸菜實(shí)驗(yàn)組的1/4。可以看出，在腌制蔬菜的過(guò)程中，加酸菜水比加老酸菜更能有效降低亞硝酸鹽含量，原因是加的酸菜水中比加的老酸菜中含有更多的乳酸菌，A1、A2乳酸菌菌種優(yōu)勢(shì)較A3、A4大，能有效抑制雜菌的生長(zhǎng)，從而抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生[10]。另外，加酸水菜的蔬菜中pH更低，有利于乳酸菌生長(zhǎng)進(jìn)而抑制雜菌的生長(zhǎng)。此外酸也能使產(chǎn)生的亞硝酸鹽分解，從而使亞硝酸鹽含量降低，同時(shí)使亞硝峰延遲。

2.2.3 3種外加輔助發(fā)酵物質(zhì)的亞硝酸鹽含量降低效果

分析比較3種外加輔助發(fā)酵物質(zhì)(酸菜水、老酸菜、面水)對(duì)酸菜腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量降低的能力。

圖3 酸菜水、老酸菜、面水比較圖Fig.3 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water, mature pickled Chinese cabbage,flour water

由圖3可知，比較A3與A5得出，僅加老酸菜較僅加面水能快速降解腌制過(guò)程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽，并且使亞硝峰提前，整個(gè)腌制過(guò)程亞硝酸鹽含量更少，原因是僅加面水乳酸菌含量較僅加老酸菜乳酸菌含量少，僅來(lái)源于原料自帶乳酸菌，面水促進(jìn)雜菌與乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中，前4天亞硝酸鹽產(chǎn)生量大于消除量，亞硝峰推遲。并且由于A5后期雜菌較多，乳酸菌菌種優(yōu)勢(shì)不顯著，所以后期亞硝酸鹽降低較為緩慢。在研究腌制酸菜過(guò)程中降低亞硝酸鹽含量的方法中，根據(jù)其整個(gè)腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量降低效果對(duì)3種腌制過(guò)程中添加的外加輔助發(fā)酵材料排序，效果由好到差依次為：酸菜水>老酸菜>面水。

2.2.4 酸菜水、面水、老酸菜降低亞硝酸鹽含量能力比較

分析確定酸菜腌制過(guò)程中，加入的酸菜水與老酸菜處于發(fā)酵降低亞硝酸鹽主導(dǎo)地位，面水處于輔助地位。

圖4 酸菜水+面水、老酸菜+面水、面水比較分析圖Fig.4 Comparison and analysis chart of pickled Chinese cabbage water+flour water,mature pickled Chinese cabbage+flour water,flour water

由圖4可知，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均加有面水，A5為僅加入面水實(shí)驗(yàn)組，其整個(gè)腌制過(guò)程亞硝酸鹽前5天均處于超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水平的狀態(tài)。A5基礎(chǔ)上加入老酸菜后即A4組，整個(gè)腌制過(guò)程中亞硝酸鹽相對(duì)于A5實(shí)驗(yàn)組降低明顯，尤其是達(dá)到峰值后亞硝酸鹽降解速度明顯加快。若在A5基礎(chǔ)上加入酸菜水即A2實(shí)驗(yàn)組，其整個(gè)腌制過(guò)程亞硝酸鹽降低顯著，其峰值僅為A5的1/4。由此比較說(shuō)明，3個(gè)外加輔料中加入酸菜水與老酸菜處于發(fā)酵降低亞硝酸鹽主導(dǎo)地位，面水處于輔助地位。

2.2.5 食鹽和泡菜水對(duì)酸菜亞硝酸鹽含量的影響

圖5 食鹽、食鹽+泡菜水對(duì)比圖Fig.5 Comparison chart of salt,salt+pickle water

由圖5可知，所取泡菜水本身含有亞硝酸鹽，但整個(gè)腌制過(guò)程中“泡菜水+食鹽”對(duì)應(yīng)腌制方法的酸菜亞硝酸鹽含量更低，并且降解的速率也較快，原因是泡菜水比蔬菜自身含有更多的乳酸菌[11]，同時(shí)食鹽形成的高滲透環(huán)境抑制雜菌生長(zhǎng)，酸性環(huán)境既促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)又促進(jìn)亞硝酸鹽降解，從而能有效降解蔬菜腌制過(guò)程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽。因此在腌制蔬菜時(shí)，加入適量的泡菜水與食鹽能有效降解酸菜腌制過(guò)程中的亞硝酸鹽，而且其整個(gè)腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量均在8 mg/kg以下。另外，僅加食鹽其亞硝酸鹽含量也在12 mg/kg以下，與僅加面水相比能顯著降低亞硝酸鹽含量，其原因是高濃度的食鹽對(duì)細(xì)菌有抑制作用，雖然乳酸菌同時(shí)被抑制，但雜菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽較少，同時(shí)乳酸菌逐漸形成的酸性環(huán)境有利于乳酸菌生長(zhǎng)，因此酸菜中亞硝酸鹽處于一個(gè)較低的水平。

2.2.6 7種酸菜腌制方法的亞硝酸鹽含量降低效果

圖6 7種腌制方法亞硝酸鹽平均含量柱狀圖Fig.6 Column chart of average nitrite content in seven pickling methods

各實(shí)驗(yàn)組整個(gè)發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽平均含量可間接反應(yīng)各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽總含量。由圖6可知，A1組平均亞硝酸鹽濃度最小，但A2與A1僅相差0.25 mg/kg，非常接近，且由前面分析可知A2亞硝峰更低，所以A1與A2所對(duì)應(yīng)腌制方法的選擇可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需求確定。以各實(shí)驗(yàn)組亞硝酸鹽平均濃度為標(biāo)準(zhǔn)為各實(shí)驗(yàn)組亞硝鹽降低效果從大到小排序?yàn)椋篈1>A2>A6>A7>A4>A3>A5。

3 結(jié)論

酸菜水與面水同時(shí)加入是幾種實(shí)驗(yàn)組中降低亞硝酸鹽最顯著的方法，并且其推遲亞硝峰的出現(xiàn)。食鹽與泡菜水都能顯著降解整個(gè)腌制過(guò)程中的亞硝酸鹽，但在食鹽基礎(chǔ)上加入泡菜水能使整個(gè)腌制過(guò)程中的亞硝酸鹽更低。

在腌制蔬菜的過(guò)程中，加入適量的酸菜水、老酸菜、泡菜水、食鹽都能降低蔬菜腌制過(guò)程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽。7種組合腌制方法中降低亞硝酸鹽效果以亞硝酸鹽平均濃度為標(biāo)準(zhǔn)從大到小排序?yàn)椋篈1>A2>A6>A7>A4>A3>A5。以各實(shí)驗(yàn)組亞硝峰的峰值為標(biāo)準(zhǔn)從大到小排序?yàn)椋篈2>A7>A1>A6>A4>A3>A5。在本研究方案下，亞硝酸鹽消除效果為：南方北方腌制方法結(jié)合>南方腌制方法>北方腌制方法。

無(wú)論哪種腌制方法，在腌制過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽，并且都會(huì)出現(xiàn)一個(gè)“亞硝峰”，這一“亞硝峰”是不可消除的[12]。以山葵為材料，加入酸菜水、泡菜水、食鹽所對(duì)應(yīng)的腌制方法其亞硝峰都低于食品監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)30mg/kg，即整個(gè)腌制過(guò)程中都可食用。但是新鮮蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量與蔬菜的種屬、生長(zhǎng)期、栽培條件及蔬菜部位等因素有關(guān)。新鮮蔬菜的硝酸鹽與亞硝酸鹽含量大，則酸菜腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量也大，反之亦然。但總體來(lái)說(shuō)，若采用本實(shí)驗(yàn)中降低亞硝酸鹽效果較好的幾種方法會(huì)使整個(gè)腌制過(guò)程中亞硝酸鹽含量低于30mg/kg，整個(gè)腌制過(guò)程都可以食用。

4 展望

接種乳酸菌發(fā)酵制作的泡菜風(fēng)味由于其菌種單一，沒(méi)有自然發(fā)酵風(fēng)味好[13，14]，酸菜與泡菜發(fā)酵原理基本相同，所以其風(fēng)味也是自然發(fā)酵更好。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趯?duì)生活中常用酸菜腌制方法進(jìn)行研究與改進(jìn)，完全采用日常生活中酸菜的腌制方法。為了便于生活運(yùn)用，本實(shí)驗(yàn)以輔助發(fā)酵物質(zhì)的添加量為標(biāo)準(zhǔn)，并未按照乳酸菌的量進(jìn)行特殊輔助發(fā)酵物質(zhì)的添加。在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)由于外加輔助發(fā)酵物質(zhì)的乳酸菌含量不同，導(dǎo)致與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差別的現(xiàn)象，因此本實(shí)驗(yàn)給出了外加輔助發(fā)酵物質(zhì)中乳酸菌含量以供實(shí)踐者參考，同時(shí)也能啟發(fā)相關(guān)食品工廠根據(jù)此參數(shù)進(jìn)行定量研究生產(chǎn)。