茄褐紋病菌的分離鑒定及培養(yǎng)基篩選

馬珂

摘 ?要：對茄褐紋病菌的形態(tài)及適宜培養(yǎng)基類型進行了分析，在茄子的不同發(fā)病部位分離出α型、β型2種分生孢子;實驗結果顯示，燕麥培養(yǎng)基是最適宜褐紋病菌產孢的培養(yǎng)基，其次為PSA。

關鍵詞：茄褐紋病菌;分離鑒定;培養(yǎng)基;篩選

中圖分類號 S436.411文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）10-0074-03

褐紋病（Phomopsis vexans）是茄子重要的病害之一，主要危害茄子果實，影響果實的商品性。一般造成果腐發(fā)生率在20%～30%[1]，嚴重的高達80%[2，3]，茄子采種田因褐紋病的大發(fā)生而導致種子嚴重減產，甚至絕收。

茄褐紋病菌屬半知菌亞門球殼孢目擬莖點霉屬，病斑上產生的黑色分生孢子器初埋生于寄主表皮下，成熟后突破表皮而外露;孢子器單獨地生子座上，呈凸透鏡形，具有孔口，在自然狀態(tài)下，Phomopsis的分生孢子器多數(shù)僅含有α-型孢而無β-型孢，年佳續(xù)[4]綜合論述了擬莖點霉屬的檢測技術，認為形態(tài)學鑒定的傳統(tǒng)方法仍是主要鑒定方法之一。羅利娟[5]對8種擬莖點霉在不同培養(yǎng)條件下的產孢情況進行了研究，以其解決自然條件下擬莖點霉屬的鑒定問題。陳永青、姜子德[6，7]分別用分子生物學的方法對多種擬莖點霉屬真菌進行了系統(tǒng)研究，結果表明，Phoma與Phomopsis兩屬之間缺乏明顯的區(qū)分界限，在Phomopsis的分類地位上仍存在著界限模糊的問題。周永力[8]對Phomopsis的個體發(fā)育做了較為具體的闡述，主要涉及人工培養(yǎng)條件下的Phomopsis的產孢形式、孢子形態(tài)及菌落的生長特點等方面。油球是Phomopsis屬的一個穩(wěn)定的特征，可作為該屬的判斷依據(jù)。溫度成為影響孢子類型產生不同的主要因素，傳統(tǒng)觀點認為，不同類型的孢子形態(tài)的產生是與所發(fā)病的植株部位有關，在自然狀態(tài)下，Phomopsis的分生孢子器大多僅含有α-型孢而無β-型孢。本研究通過對采集樣本的徒手切片、鏡檢，以及篩選適宜培養(yǎng)基等方法，在較短時間內用較為經(jīng)濟的手段，對茄褐紋病菌進行準確的初判，并對茄褐紋病菌的產孢條件進行了進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 HA、HB采自安徽合肥，HY采自安徽和縣。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

1.2 儀器及試劑 光學顯微鏡，顯微攝像顯微鏡 （OLYMPUS），解剖刀，鑷子，剪刀，培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，恒溫箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 病原菌分離純化 采用PDA培養(yǎng)基進行常規(guī)組織分離法，于25℃培養(yǎng)純化，記錄菌落的形態(tài)和顏色，同時對病組織進行徒手切片、鏡檢，觀測病原菌形態(tài)。并按柯赫氏法則[9]加以確認，獲得茄褐紋病菌菌株3株，分別編號HA、HB、HY。

1.3.2 培養(yǎng)基篩選

1.3.2.1 實驗培養(yǎng)基的制備 （1）PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL;（2）PSA+VB1培養(yǎng)基：在原有PDA培養(yǎng)基成分中添加5mg維生素B1;（3）燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30g，瓊脂20g，水1000mL;（4）胡蘿卜培養(yǎng)基：200g胡蘿卜榨汁，25g瓊脂，水1000mL;（5）大豆培養(yǎng)基：干豆140g浸泡數(shù)小時后磨漿榨汁，瓊脂4g，水1000mL;（6）玉米培養(yǎng)基：玉米粉300g，瓊脂17g，水1000mL;（7）蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5g，蔗糖10g瓊脂14g，水1000mL;（8）查彼培養(yǎng)基：蔗糖30g，硝酸鈉2g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂17g，水1000mL;（9）茄汁培養(yǎng)基：茄子200g榨汁，瓊脂25g，水1000mL。

1.3.2.2 菌絲生長速率的測定 將茄褐紋病菌菌株HA、HB、HY分別在PDA斜面上活化3d，然后轉移至PSA平板上培養(yǎng)5d。在培養(yǎng)好的菌落平板上沿菌絲生長邊緣用打孔器打直徑為6mm的小菌碟，分別移置不同培養(yǎng)基平板的中央，3次重復。25℃條件下恒溫培養(yǎng)，3d后按十字交叉法測量菌落的直徑，取平均值，測定生長速率。

2 結果與分析

2.1 茄褐紋病病原的鑒定 茄褐紋病菌存在2種分生孢子：α型及β型分生孢子。α-型孢子為單孢，無色、長圓柱形、球形、梭形，1端或2端較尖，有1～2個大油球或兩端各聚集多個小油球。β型呈細長線狀，并在一端彎曲成鉤，兩者均為無色單胞。經(jīng)鏡檢得知，寄主發(fā)病部位不同，其分生孢子類型有明顯差異：果實上分離的分生孢子有2種類型，其中多數(shù)為α型分生孢子，伴有少量的β型分生孢子;從莖稈上的病斑采集到的都是β型分生孢子;葉片上的均為α型分生孢子。各部位分生孢子形態(tài)見圖1，分生孢子器形態(tài)見圖2。

2.2 培養(yǎng)基的篩選 3個褐紋病菌菌株在9種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及產孢情況結果見表1，菌株生長情況結果見圖3。由表1可知，能夠產孢的培養(yǎng)基有PSA、燕麥、玉米、胡蘿卜，其產孢量依次為燕麥>PSA≥玉米>胡蘿卜，產孢時間除胡蘿卜培養(yǎng)基的時間在15d以上外，其他3種培養(yǎng)基的產孢時間都在10d以上。由圖3可知，菌絲生長較好的培養(yǎng)基種類有PSA、茄汁、玉米，不適合菌絲生長培養(yǎng)基為查彼和蛋白胨。3個菌株在不同的培養(yǎng)基上的菌絲生長情況存在差異，HA菌絲生長最適的培養(yǎng)基為茄汁培養(yǎng)基，HB最適的為玉米培養(yǎng)基，HY最適的為PSA培養(yǎng)基。HB在9種培養(yǎng)基上的菌絲生長情況總體上優(yōu)于HY、HA，HA的菌絲生長為最低，在產孢情況上，3個菌株的表現(xiàn)較為一致。

3 討論

茄褐紋病菌2種類型的分生孢子（β型和α型）2端的油球，已經(jīng)成為Phpmopsis的分類標志。筆者在實驗中觀察到，α型分生孢子的油球多數(shù)情況下保持在2個（1端1個），在極少數(shù)情況下，可以觀察到有3個油球存在。這一特征不僅是自然條件下形成的分生孢子，而且是人工條件下形成的分生孢子所共有的。而對于β型分生孢子，除在自然條件下較少見到外，因其不具有生殖能力，所以在一般人工培養(yǎng)條件下無β型分生孢子出現(xiàn)。目前，國內對茄褐紋病菌的分類研究仍較少，因實驗采集的菌株較少，研究存在著很大的局限性，有待于進一步深入。