韓氏內(nèi)異止痛湯對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型雌二醇和芳香化酶P450表達的影響

韓亞光，朱小琳，韓延華

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院婦科，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院治未病中心，哈爾濱 150040）

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的婦科疾病，是指子宮內(nèi)膜組織生長在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮肌層以外的部位出現(xiàn)、生長、浸潤、反復出血，可形成結(jié)節(jié)及包塊，引起疼痛、不孕等病癥。流行病學發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥在育齡期婦女中患病率高達10%～15%，并且有逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為嚴重影響婦女身體和心理健康的疾病之一。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，受雌激素調(diào)節(jié)影響[1]。雌激素的長期作用可刺激異位內(nèi)膜的增殖與生長。作為細胞外信號的雌激素，只有與雌激素受體（ER）結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學效應。芳香化酶P450 是雌激素合成的最后一步限速酶，可促進C19 雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。有研究發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜中芳香化酶P450 表達升高，由于異位內(nèi)膜中17pHSD2 含量過少，進而導致雌激素和雌二醇濃度明顯增高[2]。龍江韓氏婦科認為子宮內(nèi)膜異位癥以肝臟功能失調(diào)為主，與脾、腎兩臟密切相關，治療應從整體和局部出發(fā)，結(jié)合臨床癥狀，采用疏肝活血祛瘀止痛法，創(chuàng)立“內(nèi)異止痛湯”，同時針對不同個體辨證施治加減運用，在臨床上或得很好的療效。本研究將采用自體移植法建立EMs 大鼠模型觀察中藥內(nèi)異止痛湯對內(nèi)異癥血清中E2和異位內(nèi)膜組織勻漿液中ER、芳香化酶P450的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 性成熟雌性清潔級SD 大鼠65 只，體質(zhì)量為220 g 左右，鼠齡在7 ～8 周左右，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心（藥物安全性評價中心）[SCXK（黑）2013-004]。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學針灸驗室，清潔級環(huán)境，每6 只大鼠一籠進行飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，實驗室溫度：（22±2）℃，濕度：40%～60%，規(guī)律性光照：12 h 光照、12 h 黑夜，1 次/5 d 更換墊料。連續(xù)陰道涂片，觀察大鼠的動情周期，在所有大鼠的第三個動情周期時隨機選取57 只SD大鼠進行自體移植手術(shù)，建立子宮內(nèi)膜異位癥模型，剩余8 只SD 大鼠設為假手術(shù)組。

1.2 建立EMs 大鼠模型 術(shù)前24 h 大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 mL/kg，使其處于動情期[3]。手術(shù)在無菌環(huán)境下進行，按Vernon 等[4]的方法進行自體移植法手術(shù)建立模型。

1.3 試驗藥物 1）中藥復方內(nèi)異止痛湯主要藥物組成：當歸15 g，白芍20 g，三棱10 g，莪術(shù)10 g，丹參20 g，桃仁15 g，連翹15 g，五靈脂10 g，延胡索20 g，香附15 g，鱉甲20 g，桂枝10 g，炙甘草10 g。藥物為中藥天江顆粒。中藥由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院門診中藥局提供，江陰天江公司生產(chǎn)。2）達那唑膠囊0.2 g×30 粒，購自江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司。

1.4 分組與給藥 將造模成功后的40 只大鼠隨機分為4組：模型對照組10 只，中藥復方內(nèi)異止痛湯低劑量組10 只，中藥復方內(nèi)異止痛湯高劑量組10 只，陽性對照組（達那唑）10 只，另外假手術(shù)組8 只。根據(jù)《藥物實驗方法學》[5]，模型對照組和假手術(shù)組都給予生理鹽水2 mL/d 灌胃，達那唑組7.2 mg/kg/d灌胃，低劑量組給予245.8 mg/kg/d 灌胃，高劑量組給予985.3 mg/kg/d 灌胃，連續(xù)灌胃4 周。

1.5 實驗試劑 雌二醇（E2）試劑盒、雌激素受體（ER）試劑盒、芳香化酶P450 試劑盒，均由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.6 指標測定

1.6.1 酶聯(lián)免疫吸附法檢測E2、ER、芳香化酶P450 EMs 大鼠模型血清中的E2以及異位內(nèi)膜組織勻漿液中的ER、芳香化酶P450 用酶聯(lián)免疫吸附法進行定量測定，嚴格按照試劑盒說明書操作進行，取藥物干預后各組血清及內(nèi)膜組織勻漿液入2 mL EP 管中，放入- 20 ℃冰箱備用。試驗開始前30 min 將樣品和試劑盒移至室溫穩(wěn)定。取出酶標板，設一個空白對照孔，不加任何液體，每個標準點依次各設兩孔，加標準品每孔50 μL，依次為0 pg/mL，40 pg/mL，100 pg/mL，240 pg/mL，400 pg/mL，1 000 pg/mL；除空白對照組其余每孔加酶結(jié)合物（HRP-conjugate）50 μL，再按相同順序加入抗體（antibody）50 μL；貼上不干膠封條，搖勻；37℃溫育60 min；洗板3 次（間歇30 s）；每孔先加顯色劑A50 μL，再加顯色劑B50 μL，搖勻，37℃避光顯色15 min；每孔加終止液50 μL，終止反應。最后用450 nm 波長處讀取吸光度值，繪制標準曲線，用Curve Expert 1.4 軟件換算濃度。

1.7 統(tǒng)計方法 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異性比較用單因素方差分析。評定標準P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 治療后各組大鼠異位病灶生長情況

表1 各組大鼠異位內(nèi)膜病灶體積變化（± s ） mm3

表1 各組大鼠異位內(nèi)膜病灶體積變化（± s ） mm3

注：各治療組治療后與治療前比較，## P ＜0.01；與低劑量組治療后比較，# P ＜0.05；與西藥組治療后比較，△P ＞0.05；與模型組治療前比較，▲P ＞0.05

組 別 給藥量/（mg/kg） 治療前 治療后 體積變化模型組-108.72±23.43105.26±26.21▲ 3.46±6.70中低組 245.8 106.39±27.36 48.76±15.17##57.63±20.39中高組 985.3 110.23±21.01 28.99±9.01## 81.24±23.67#△西藥組 7.2 116.52±27.37 28.81±8.85## 87.71±25.61

造模成功后，各組大鼠治療4 周后二次開腹，測量異位病灶組織大小，采取同側(cè)與用藥前比較，結(jié)果提示：模型組治療前后子宮內(nèi)膜異位病灶的組織囊腫體積無顯著改變（P＞0.05）；中藥高劑量、中藥低劑量和西藥組子宮內(nèi)膜異位病灶與治療前相比，體積明顯縮小，有統(tǒng)計學意義，（P＜0.01）；中藥高劑量治療組異位病灶體積縮小程度明顯優(yōu)于中藥低劑量治療組（P＜0.05）；其與西藥組相比體積大小無明顯差別（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

圖1 各組大鼠異位內(nèi)膜病灶體積變化

2.2 內(nèi)異止痛湯對EMs 大鼠血清中E2的影響 各組大鼠血清中E2酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，內(nèi)異止痛湯低劑量組E2含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；內(nèi)異止痛湯高劑量組和西藥組與模型組相比，E2含量明顯降低（P＜0.01）；與內(nèi)異止痛湯低劑量組相比，內(nèi)異止痛湯高劑量組對EMs 模型大鼠血清E2含量降低更為顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中E2 結(jié)果（± s）

表2 各組大鼠血清中E2 結(jié)果（± s）

注：與模型組比較，## P ＜0.01，# P ＜0.05；與低劑量組比較，△P ＜0.05

組 別 例數(shù) E2西藥組 10 136.945±11.015##低劑量組 10 159.869±12.146#高劑量組 10 144.652±6.341##△模型組 10 175.562±8.438假手術(shù)組 8 116.983±4.892

2.3 內(nèi)異止痛湯對EMs 大鼠異位內(nèi)膜組織中ER、芳香化酶P450 的影響 各組大鼠異位內(nèi)膜組織勻漿液中ER 和芳香化酶P450 酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，內(nèi)異止痛湯低劑量組ER 和芳香化酶P450 含量降低（P＜0.05）；內(nèi)異止痛湯高劑量組和西藥組與模型組相比，ER 和芳香化酶P450 含量明顯降低（P＜0.01）；與內(nèi)異止痛湯低劑量組相比，內(nèi)異止痛湯高劑量組對EMs 模型大鼠異位組織中ER和芳香化酶P450 含量降低更為顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠異位內(nèi)膜組織勻漿液中ER、芳香化酶P450 結(jié)果（± s）

表3 各組大鼠異位內(nèi)膜組織勻漿液中ER、芳香化酶P450 結(jié)果（± s）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與低劑量組比較，△P ＜0.05

組 別 例數(shù) ER 芳香化酶P450西藥組 10 35.553±2.339## 295.289±8.957##低劑量組 10 40.147±2.808# 320.463±20.073#高劑量組 10 36.907±3.105##△ 296.308±18.617##△模型組 10 43.951±2.568 343.364±12.573假手術(shù)組 8 31.711±1.024 285.441±4.728

3 討論

3.1 雌激素在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮作用的途徑 雌激素為細胞外信號，只有與雌激素受體結(jié)合后才能表現(xiàn)出生物學效應，最早認為雌激素主要受雌激素受體的兩個亞基α 和β 調(diào)控，其以自由擴散的形式與雌激素受體結(jié)合，形成復合物進入細胞核，然后與指定的DNA 序列結(jié)合，最后啟動轉(zhuǎn)錄，由于這一系列過程需要數(shù)小時來完成，故稱為長期效應。Razandi 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α 和β 不僅在細胞內(nèi)表達，在細胞膜上也發(fā)現(xiàn)了雌激素受體的分布，但只占總體的2%～3%。有學者研究發(fā)現(xiàn)，雌激素與細胞膜ER 結(jié)合后可引起一系列下游信號傳導，導致細胞的生長與增殖[7]。然而雌激素膜受體被慢病毒轉(zhuǎn)染后，內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的生長與增殖明顯被抑制[8]。提示雌激素可能直接與膜受體結(jié)合后激活信號通路發(fā)揮相應的生物學效應。因此雌激素可通過2 種途徑發(fā)揮其生物學效應。

在子宮內(nèi)膜異位癥中雌激素可以通過經(jīng)典基因轉(zhuǎn)錄效應在細胞核內(nèi)完成其生物學效應，雌激素受體作為信號傳導者與雌激素結(jié)合活化，并與雌激素效應元件（ERE）結(jié)合，調(diào)控基因的表達，使細胞生長和增殖，降低E2的表達可以阻斷這一通路[9]。雌激素也可以通過非經(jīng)典轉(zhuǎn)錄效應與細胞膜受體結(jié)合，使Ras-Raf 激活并磷酸化下游底物MEK、ERK。磷酸化的ERK 進入細胞核后可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65、NF-κBp50、c-Jun、c-Fos 的表達，引起細胞的異常增殖。

3.2 內(nèi)異止痛湯對EMs 大鼠血清中E2的影響 子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，人體內(nèi)的雌激素以雌二醇活性最強。異位內(nèi)膜中的雌二醇表達異常升高，可持續(xù)刺激異位病灶，使異位內(nèi)膜不斷的增生，侵襲。有學者發(fā)現(xiàn)，隨著痛經(jīng)程度的加重，雌二醇水平不斷增高，重度患者血清中的雌二醇明顯高于輕度患者。有研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體或復方通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸，或作用性激素受體等方式，可抑制異位內(nèi)膜的生長甚至促進其萎縮。如金雀異黃素可通過降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠雌激素生成代謝酶P450，降低雌二醇水平，改善高雌激素水平。黃綺丹等[10]研究發(fā)現(xiàn)，西藥達那唑和中藥復方莪棱膠囊均可降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清中的雌二醇水平，從而改善內(nèi)異癥的相關癥狀。李紅霞等[11]在臨床上發(fā)現(xiàn)，三花益腎湯治療子宮內(nèi)膜異位癥患者后，血清中雌二醇、CA125等指標明顯下降，孕激素上升，從而使病灶縮小。本研究發(fā)現(xiàn)，各組藥物干預后，中藥復方內(nèi)異止痛湯高劑量組、低劑量組和西藥組與模型對照組相比，都能明顯的降低EMs 大鼠血清中雌二醇水平，高劑量組比低劑量組療效明顯。此結(jié)果提示，中藥復方內(nèi)異止痛湯可能通過降低子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中的雌二醇，從而抑制異位內(nèi)膜的增殖與生長，并且存在明顯的濃度依賴性。

3.3 內(nèi)異止痛湯對EMs 大鼠組織勻漿液中芳香化酶P450 的影響 芳香化酶P450 是由血紅蛋白和酶蛋白組成的一種細胞色素，屬于細胞色素P450 超家族。子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病等一些雌激素依賴性疾病的病理組織中均有芳香化酶P450 的表達，說明與這些疾病的發(fā)生發(fā)展有關。芳香化酶P450在子宮內(nèi)膜的患者體內(nèi)各個合成雌激素的環(huán)節(jié)都有表達[12]。在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜都呈現(xiàn)高表達[13]，但在健康婦女的子宮內(nèi)膜和肌層中都不表達[14]。芳香化酶P450 是雌激素合成的最后一步限速酶，可促進C19 雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。

本部分實驗提示，中藥復方內(nèi)異止痛湯可顯著的抑制EMs 大鼠異位內(nèi)膜組織勻漿液中芳香化酶P450的表達，并且高劑量組療效優(yōu)于低劑量組，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），證明療效與藥物濃度有關。說明中藥復方內(nèi)異止痛湯可能通過抑制芳香化酶P450 來阻斷與雌二醇正反饋循環(huán)，從而降低雌二醇的分泌，抑制或減少異位內(nèi)膜的增殖和生長。

3.4 內(nèi)異止痛湯對EMs 大鼠組織勻漿液中雌激素受體ER 的影響 子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，雌激素能發(fā)揮多大的生物學效應，取決于靶細胞內(nèi)雌激素受體的高低。雌激素在子宮內(nèi)膜異位癥中可通過兩種途徑進行信號傳導：1）基因轉(zhuǎn)錄：雌激素進行信號傳導是通過雌激素受體反應元件（ERE）進行的，細胞質(zhì)中的雌激素受體與配體結(jié)合后發(fā)生構(gòu)型的改變，以同聚體或異聚體的形式與雌激素受體反應元件結(jié)合，進而啟動相應的轉(zhuǎn)錄過程。2）非基因轉(zhuǎn)錄：雌激素與細胞膜雌激素受體結(jié)合后，激活信號通路，對其起到自身負反饋調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)如NF-κB和AP-1 等轉(zhuǎn)錄因子的活性，對目的基因進行轉(zhuǎn)錄或調(diào)控，參與細胞生物學效應。雌激素可直接影響異位內(nèi)膜，也可通過一些轉(zhuǎn)錄因子的表達來促進異位內(nèi)膜的發(fā)展。Vivacqua 等[15]研究證實，雌激素通過激活ER-α 調(diào)控內(nèi)膜細胞的增殖與生長。Bukulmez 等[16]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織中ER-α 表達升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥復方內(nèi)異止痛湯高劑量組、低劑量組與模型對照組相比都能夠顯著降低EMs 大鼠異位內(nèi)膜組織勻漿液中ER 的表達，并且高劑量組優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）。此結(jié)果提示：中藥復方內(nèi)異止痛湯可能通過抑制ER 的表達，從而降低雌二醇，抑制異位內(nèi)膜的生長與增值。

綜上分析，中藥復方內(nèi)異止痛湯可通過降低雌激素受體ER 的表達進而抑制雌二醇E2的生物學效應，減少異位病灶的生長與增值。另外中藥復方內(nèi)異止痛湯還可通過降低芳香化酶P450 的表達來阻斷與E2之間的正反饋循環(huán)，從而降低異位內(nèi)膜中E2的含量。

因此，雌激素對異位病灶的生物學信號減少，阻斷了異位內(nèi)膜的增殖與生長，提高了異位病灶的凋亡率，這有可能是中藥復方內(nèi)異止痛湯治療子宮內(nèi)膜異位癥的機理之一。