PDX通過(guò)P38 MAPK通路促進(jìn)膿毒癥性ARDS抗菌肽cathelicidin表達(dá)

谷麗君，潘靜怡，MOHAMED ALI Abdullahi，金勝威

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

抗菌肽是宿主在抵御外來(lái)生物入侵時(shí)固有免疫屏障產(chǎn)生的小分子多肽，能廣譜抗菌[1-2]并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[3]，其中抗菌肽cathelicidin（cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP）是主要抗菌肽家族之一。炎癥具有防御和損傷雙重效應(yīng)，炎癥后期機(jī)體通過(guò)主動(dòng)產(chǎn)生促炎癥消退介質(zhì)及時(shí)限制過(guò)度炎癥反應(yīng)，恢復(fù)機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[4-6]。Protectin DX（PDX）是來(lái)源于二十二碳六烯（docosahexaenoic acid，DHA）的促炎癥消退介質(zhì)，在多種炎癥模型中均有抗炎促消退作用[7-9]。已有研究表明促炎癥消退介質(zhì)脂氧素、消退素能促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)[10-12]，然而PDX對(duì)CAMP的影響尚不清楚，本研究主要探索PDX對(duì)CAMP的影響及其具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性C57BL/6小鼠，6～10周齡，體質(zhì)量為23～25 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào):SYXK（浙）2018-103。

1.1.2 主要試劑:PDX購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，SB203580購(gòu)于美國(guó)MCE公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，CAMP、hsp 70、serpina 3、lysozyme基因購(gòu)于上海生工生物有限公司，cathelicidin抗體、GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，ERK、P38相關(guān)抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司，β-actin多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理及分組:盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥模型:麻醉小鼠至無(wú)夾持反應(yīng)，剖腹探查找到盲腸，在回盲瓣至盲腸末端中間處用外科線結(jié)扎腸管，20 G針頭從腸系膜刺向游離側(cè)，并對(duì)穿。用鑷子輕柔擠壓腸管，擠出適量腸內(nèi)容物?；丶{盲腸，依次縫合腹膜，肌肉，皮膚。術(shù)后皮下補(bǔ)液0.9%氯化鈉溶液1 mL，注意保溫。術(shù)后12 h取組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。先取24只小鼠進(jìn)行CAMP時(shí)效檢測(cè):假手術(shù)組（Sham組）（n=4）:術(shù)后即刻取肺組織；膿毒癥組（CLP組）:制作膿毒癥小鼠模型，分別于1、3、6、12、24 h處死小鼠（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只），取肺組織行Western blot檢測(cè)CAMP表達(dá)。動(dòng)物分組，每組6只:假手術(shù)組（Sham組）:暴露盲腸，不予結(jié)扎穿孔并回納，縫合腹膜及皮膚；膿毒癥組（CLP組）:暴露盲腸，上述方式結(jié)扎穿孔后回納；治療組（CLP+PDX組）:盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后2 h腹腔注射PDX 300 ng/只；抑制劑組（CLP+PDX+SB203580組）:造模前2 h腹腔注射SB203580（15 mg/kg），盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后2 h腹腔注射PDX 300 ng/只；溶劑對(duì)照組（CLP+PDX+DMSO組）:術(shù)前2 h腹腔注射等體積1% DMSO，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后2 h腹腔注射PDX 300 ng/只；PDX組:暴露盲腸，不予結(jié)扎穿孔即回納，腹腔注射PDX 300 ng/只。

1.2.2 HE染色:于規(guī)定時(shí)間進(jìn)行小鼠麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死。摘取小鼠右肺中葉浸泡于4%多聚甲醛（10 mL）固定24 h，常溫石蠟包埋5 μm切片。分別經(jīng)脫蠟、復(fù)水、反藍(lán)、透明操作后封片，然后在顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.3 菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）:小鼠麻醉至無(wú)夾持反應(yīng)，剖胸固定，打開心包，于左右心室暗帶交接處穿刺進(jìn)針采血（注意抗凝），取樣完成進(jìn)行涂布。按照原液，1/10原液，1/100原液濃度梯度進(jìn)行稀釋，用滅菌三角涂布棒蘸取各濃度標(biāo)本于瓊脂糖平板進(jìn)行均勻涂布。涂布完成后，干燥20～30 min，倒置培養(yǎng)皿于37 ℃培養(yǎng)箱培育。12 h后取出樣品，計(jì)數(shù)分析。將計(jì)數(shù)平面均分為若干塊，隨機(jī)選取3塊計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.2.4 RT-PCR:液氮研磨肺組織，TRIzol溶劑提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，混合RT-PCR體系及引物，上機(jī)。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min進(jìn)入循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ l min，40個(gè)循環(huán)；進(jìn)入融解曲線階段，60 ℃ l min，95 ℃15 s。將PCR所得到的目的基因CT值與其對(duì)應(yīng)內(nèi)參CT值相減得到ΔCT，再與對(duì)照組的ΔCT相減得到ΔΔCT，則目的基因的量為2-ΔΔCT。引物序列為:serpina3:5'-ACGAGTCCACCACGGTGAAGG-3'，5'-AGAAGGAAGACAGC AGTGGCATTG-3'；hsp70:5'-CCAAGGTGCAGGTGAACTACA AGG-3'，5'-GCCGCTGAGAGTCGTTGAAGTAG-3'；lysozyme:5'-TCGGAACTGCGGAGTCTGACC-3'，5'-GCTGAAGCTTGTGAG GAGGAAGTC-3'；CAMP:5'-CACTATCACTGCTGCTGCTACTG G-3'，5'-AGTCTCCTTCACTCGGAACCTCAC-3'。

1.2.5 Western blot:肺組織標(biāo)本加入RIPA裂解液，使用研磨管在冰盒上將標(biāo)本研磨成勻漿，使用超聲裂解液進(jìn)一步裂解組織，離心12 000×g，30 min，上清液即為總蛋白。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，10%脫脂牛奶封閉，CAMP（1:1 000）、磷酸化P38（1:1 000）、總P38（1:1 000）、磷酸化ERK（1:1 000）、總ERK（1:1 000）、GAPDH（1:1 000）和β-actin（1:1 000）抗體4 ℃搖床孵育，過(guò)夜；對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h；通過(guò)ECL顯色，X線膠片曝光成像，使用ImageJ分析圖像，得出灰度值，對(duì)目的蛋白/內(nèi)參比值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以形式表示；多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDX對(duì)膿毒癥性ARDS的保護(hù)作用 HE染色檢測(cè)肺損傷情況，結(jié)果顯示，相對(duì)于Sham組肺組織結(jié)構(gòu)，CLP組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺組織間液明顯增多，肺出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；PDX處理能顯著改善膿毒癥模型造成的肺損傷（P＜0.05）；同時(shí)PDX顯著抑制血清炎性因子TNF-α、IL-6水平（P＜0.05）。見圖1。小鼠心臟采血進(jìn)行CFU檢測(cè)，結(jié)果顯示PDX組和Sham組CFU計(jì)數(shù)結(jié)果為陰性，CLP+PDX組菌落計(jì)數(shù)明顯低于CLP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 HE染色檢測(cè)肺損傷情況及小鼠血清炎癥因子測(cè)定結(jié)果

圖2 CFU檢測(cè)菌落形成情況

2.2 PDX促進(jìn)膿毒癥小鼠CAMP的表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于Sham組，CLP組serpina 3、hsp70、lysozyme這3種抗菌肽基因表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham組比，CLP組CAMP基因表達(dá)上調(diào)，經(jīng)PDX作用后，CAMP基因表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)（P＜0.05），見圖3。Western blot結(jié)果顯示，膿毒癥模型中CAMP蛋白表達(dá)于6 h內(nèi)達(dá)到高峰，且CLP組表達(dá)量高于Sham組，CLP+PDX組CAMP蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.3 PDX通過(guò)P38 MAPK通路促進(jìn)CAMP的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比，CLP組ERK MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CLP組p-P38/t-P38比值較Sham組有所下降。PDX處理后，p-P38/t-P38比值明顯上升，CAMP蛋白表達(dá)亦明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與CLP+PDX組比，加入P38 MAPK抑制劑SB203580后，CAMP蛋白的表達(dá)顯著下降，提示PDX對(duì)CAMP的促進(jìn)作用被阻斷（P＜0.05），見圖5。以上結(jié)果提示PDX通過(guò)P38 MAPK通路促進(jìn)CAMP的表達(dá)。

3 討論

圖3 hsp70、serpina 3、lysozyme、CAMP基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 Western blot檢測(cè)CAMP蛋白的表達(dá)

圖5 Western blot檢測(cè)P38 MAPK、ERK MAPK及CAMP蛋白的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)PDX通過(guò)P38 MAPK通路促進(jìn)膿毒癥性急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）CAMP的表達(dá)。盲腸結(jié)扎穿孔模型是經(jīng)典的膿毒癥模型，混合革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌群感染[13]。膿毒癥多器官功能障礙最常累及的是肺組織[14]，盡管ARDS多源自肺部本身，遠(yuǎn)處感染如腹部感染也是ARDS常見的誘發(fā)因素[15]。本研究采用CLP模型深入探討膿毒癥性ARDS發(fā)病機(jī)制。Serpina3、hsp70、lysozyme、CAMP是不同種類抗菌肽[16-18]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PDX不影響serpina3、HSP70、lysozyme基因的表達(dá)，然而PDX能增加CAMP基因表達(dá)。Western blot的結(jié)果也提示PDX能增加膿毒癥小鼠肺組織CAMP蛋白的表達(dá)。肺組織損傷評(píng)分結(jié)果提示PDX對(duì)于膿毒癥模型下的肺損傷有顯著保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示:PDX可能通過(guò)增加小鼠肺組織CAMP的表達(dá)保護(hù)膿毒癥造成的肺損傷。

為探究PDX對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用，使用HE染色觀察PDX對(duì)膿毒癥性ARDS肺損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDX干預(yù)后肺組織間液滲出減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血明顯緩解。同時(shí)，血清ELISA結(jié)果提示PDX顯著抑制血清炎性因子TNF-α、IL-6水平，證實(shí)PDX對(duì)膿毒癥性ARDS有保護(hù)作用。同時(shí)我們采用CFU檢測(cè)菌落形成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDX能抑制菌落形成，增加細(xì)菌清除率。

PDX是促炎癥消退介質(zhì)的一種，其受體未知，G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）120是可能受體之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)GPR120（數(shù)據(jù)未顯示）變化不明顯，提示PDX可能通過(guò)其他相關(guān)受體影響CAMP的表達(dá)。JUNG等[8]的實(shí)驗(yàn)研究證明，PDX可能通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）參與胰島素抵抗；PDX同樣通過(guò)PPARα受體參與到巨噬細(xì)胞的極化[20]；因此，PDX通過(guò)何種受體影響CAMP的表達(dá)有待繼續(xù)研究。

關(guān)于CAMP的表達(dá)機(jī)制有很多，黃芪多糖能激活P38 MAPK/JNK和NF-κB通路促進(jìn)上皮細(xì)胞CAMP的表達(dá)[21]；IL-12和IL-18共同作用激活P38 MAPK和STAT4通路，進(jìn)而刺激人巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞CAMP的表達(dá)[22]；本研究探討了MAPK通路中的ERK和P38通路。Western blot結(jié)果顯示，PDX對(duì)ERK MAPK表達(dá)無(wú)明顯影響，提示PDX可能通過(guò)其他通路影響CAMP表達(dá)。與此同時(shí)，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Sham組，CLP組小鼠P38通路被抑制，然而PDX干預(yù)明顯激活P38 MAPK通路，同時(shí)上調(diào)CAMP表達(dá)。加入P38 MAPK抑制劑SB203580后發(fā)現(xiàn)，PDX對(duì)CAMP的表達(dá)影響消失了，由此我們可以推斷，PDX通過(guò)調(diào)控P38 MAPK通路影響CAMP的表達(dá)。研究顯示，CAMP的表達(dá)與NF-κB[21，23-24]相關(guān)，然而PDX是否通過(guò)影響NF-κB的激活，從而影響CAMP的表達(dá)，這一點(diǎn)還需繼續(xù)探索。

綜上所述，PDX通過(guò)影響P38 MAPK通路，從基因水平以及蛋白水平增加膿毒癥性ARDS抗菌肽CAMP的表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)菌清除率，改善肺部炎癥狀態(tài)，促進(jìn)炎癥及時(shí)消退，保護(hù)膿毒癥小鼠肺損傷。