純水中檢測(cè)汞離子與銀離子的菲啰啉類熒光探針

廖 賢，袁劍英，牟 蘭 ，曾 晞

(貴州省大環(huán)化學(xué)及超分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

汞及其化合物廣泛應(yīng)用于化工、照明、醫(yī)療器械等領(lǐng)域。汞又是最具毒性的金屬之一，人體內(nèi)積累的汞可導(dǎo)致認(rèn)知損傷、運(yùn)動(dòng)障礙、失明、胚胎發(fā)育異常等，嚴(yán)重時(shí)將致人死亡[1-2]。人類活動(dòng)產(chǎn)生的汞易隨空氣及水體遷移擴(kuò)散，不僅可長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，而且會(huì)隨著食物鏈不斷循環(huán)累積，因此汞污染對(duì)環(huán)境有著深遠(yuǎn)的影響[3-4]。銀是貴金屬元素之一，含銀化合物被廣泛用于感光膠片洗印、金屬冶煉加工和電鍍等行業(yè)[5-7]。然而即使低濃度的銀也對(duì)水生生物有著巨大危害，不僅會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類死亡，且當(dāng)其經(jīng)由水體進(jìn)入人體時(shí)，還會(huì)沉著于各個(gè)器官中，進(jìn)而影響視力、引發(fā)癲癇等[8]。因此環(huán)境中的痕量汞及銀的檢測(cè)對(duì)于保護(hù)人類健康以及自然環(huán)境有重要意義。

目前檢測(cè)Hg2+及Ag+的方法有原子吸收光譜法[9-10]、原子發(fā)射光譜法[11]等，但存在樣品預(yù)處理步驟繁瑣或儀器昂貴等不足。熒光探針因具有靈敏性高、選擇性好、響應(yīng)時(shí)間短、便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[12]。但是目前大多數(shù)熒光探針受溶解性限制，不能在純水介質(zhì)中識(shí)別檢測(cè)Hg2+及Ag+[13-15]，極大影響了這些探針在實(shí)際中的應(yīng)用。故迫切需要構(gòu)建一種可以在純水介質(zhì)中識(shí)別Hg2+及Ag+的新型熒光探針。

1,10-菲啰啉是一類含氮雜環(huán)化合物，其光電性質(zhì)出色且易于修飾[16]，是研究最早和應(yīng)用最廣的含氮雜環(huán)化合物之一[17]。菲啰啉類熒光探針被廣泛報(bào)道，如Li等[18]通過(guò)模擬綠色熒光蛋白設(shè)計(jì)得到了一種包含菲啰啉基團(tuán)的化合物，該化合物對(duì)Zn2+具有選擇性熒光增強(qiáng)的結(jié)合行為，此識(shí)別過(guò)程可應(yīng)用于細(xì)胞成像；李俊等[15]在菲啰啉上引入兩個(gè)水楊醛基團(tuán)，成功獲得了一類能選擇性識(shí)別Cu2+和Ag2+的受體分子;Algi等[19]也基于菲啰啉結(jié)構(gòu)骨架設(shè)計(jì)合成了在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)與水的混合溶劑中對(duì)Zn2+、Cd2+、Ni2+、Cu2+具有識(shí)別功能的熒光探針；Alreja等[20]報(bào)道了一種菲啰啉衍生物，其對(duì)Cu2+表現(xiàn)出良好的選擇性。但已報(bào)道的菲啰啉類熒光探針存在水溶性較差及選擇性不佳等問(wèn)題，本文用1-溴乙酸對(duì)中間體a進(jìn)行修飾，使探針的極性和水溶性得到增強(qiáng),從而獲得了可在純水介質(zhì)中檢測(cè)Hg2+和Ag+的水溶性探針1，其合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 探針1 的合成路線Fig.1 Scheme synthesis of probe 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WNMR-I 500 MHz核磁共振儀(中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)；Nano ITC等溫滴定量熱儀(美國(guó)TA儀器公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)；Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀( 美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Vertex 70 FT-IR紅外光譜儀(布魯克光譜儀器公司)。

2,9-二甲基-1,10-菲羅啉、吡啶-3-甲醛、酸酐、溴乙酸等購(gòu)于上海晶純化學(xué)試劑公司，金屬高氯酸鹽購(gòu)于Aldrich and AlfaAesar化學(xué)試劑公司。所有藥品均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 探針1的合成

中間體a的合成：在50 mL三口瓶中，加入2,9-二甲基-1,10-菲羅啉(500 mg，2.4 mmol)、吡啶-3-甲醛(520 mg，4.8 mmol)、乙酸酐20 mL，N2保護(hù)下回流4 h，反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸去溶劑，柱層析(V乙酸乙酯∶V正己烷=2∶8)純化，得350 mg黃色固體a，產(chǎn)率37.7%;1H NMR(500 MHz,CDCl3,ppm)δ:8.90(s,2H),8.58-8.57(d,J=5 Hz,2H),8.29-8.27(d,J=10 Hz,2H),8.05-8.04(d,J=5 Hz,2H),7.96-7.95(d,J=5 Hz,2H),7.84-7.74(m,6H),7.40-7.37(m,2H)。

探針1的合成：在100 mL三口瓶中，加入中間體a(250 mg，0.64 mmol)、溴乙酸(520 mg，3.11 mmol)、乙腈50 mL，N2保護(hù)下回流24 h，反應(yīng)結(jié)束后有黑色沉淀析出，過(guò)濾得到產(chǎn)物，濾液減壓除去溶劑，用丙酮重結(jié)晶，兩次共得390 mg探針1，產(chǎn)率91.7%;1H NMR(500 MHz,D2O,ppm)δ:8.97(s,2H),8.69-8.68(d,J=5 Hz,2H),8.59-8.57(d,J=10 Hz,2H),8.19-8.17(d,J=10 Hz,2H),7.91-7.90(t,J=5 Hz,2H),7.62(s,4H),7.54-7.51(d,J=15 Hz,2H),7.39-7.36(d,J=15 Hz,2H),5.36(s,4H);IR(KBr，cm-1)σ：3 421,2 059,1 634,1 537,1 379,1 158,1 088,968,874,815,710,675,613,521;MS(ESI)m/z:665.077[M+H]+。

1.3 溶液配制

用水溶解探針1，配制成濃度為0.1 mmol/L 的儲(chǔ)備液。金屬離子的高氯酸鹽均用水溶解，配制成濃度為20 mmol/L 的儲(chǔ)備液。

1.4 光譜測(cè)量

在10 mL容量瓶中分別加入探針1儲(chǔ)備液(0.1 mmol/L,1.0 mL)和金屬離子儲(chǔ)備液，并用水溶液稀釋至刻度，搖勻，測(cè)定熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，狹縫為5 nm。

1.5 1H NMR滴定

于一系列核磁管中分別加入500 μL 1 mmol/L的探針1，再分別加入0、0.5、1.0 mmol/L的高氯酸汞，或0、0.25、0.5、1.0 mmol/L的高氯酸銀。溶劑為DMSO-D6，25 ℃下測(cè)定核磁共振氫譜(500 MHz)。

1.6 等溫量熱滴定

于樣品池內(nèi)加入探針1溶液(0.1 mmol/L,1.0 mL)，溫度設(shè)定為18 ℃，將Hg2+或Ag+的水溶液(2 mmol/L)吸入100 μL的滴定注射器中，設(shè)定攪拌速率為250 r/min，連續(xù)滴定，一滴體積為4 μL，每滴間隔250 s，共滴25次。參比池內(nèi)注入水作為樣品池的熱平衡參照，并進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)以避免稀釋熱的影響。使用該儀器上搭載的Launch Nano Analyze軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。以非線性最小方差擬合，計(jì)算相關(guān)參數(shù)。

圖2 探針1(10 μmol/L，H2O)與不同金屬離子(0.2 mmol/L)作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of probe 1(10 μmol/L,H2O) with different metal ions(0.2 mmol/L)λex/λem=350 nm/475 nm;other metals:Mg2+,Li+,Na+,Ca2+,K+,Ba2+,Zn2+,Cu2+,Sr2+,La3+,Co2+,Ni2+,Pb2+,Cd2+,Al3+,Cr3+,Fe3+

2 結(jié)果與討論

2.1 探針1對(duì)Hg2+、Ag+離子的識(shí)別

為了考察探針1對(duì)金屬離子的識(shí)別性能，測(cè)定了探針1水溶液(10 μmol/L)中分別加入不同金屬離子后的熒光光譜(圖2)。探針1溶液在475 nm處有很強(qiáng)的熒光發(fā)射，分別加入0.2 mmol/L的Hg2+或Ag+后熒光猝滅。而在同樣條件下，向探針1溶液中分別加入0.2 mmol/L的Mg2+、Li+、Na+、Ca2+、K+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Sr2+、La3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Cr3+、Fe3+,卻幾乎不能使探針1的熒光光譜發(fā)生任何變化。這表明探針1可以選擇性識(shí)別Hg2+及Ag+。

為了研究其它金屬離子對(duì)探針1選擇性識(shí)別過(guò)程的影響，向存在0.2 mmol/L Hg+或Ag2+的探針1水溶液(10 μmol/L)中分別加入0.2 mmol/L的Mg2+、Li+、Na+、Ca2+、K+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Sr2+、La3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Cr3+、Fe3+后測(cè)量475 nm處熒光強(qiáng)度(圖3)，結(jié)果表明探針1對(duì)Hg2+、Ag+的識(shí)別基本不受上述其它金屬離子的影響。

圖3 共存金屬離子對(duì)探針1識(shí)別Hg2+(A)、Ag+(B)的影響Fig.3 Fluorescence response of probe 1(10 μmol/L，H2O) and different coexisting ions of Hg2+(A) or Ag+(B)black bars:emission intensity of probe 1 on addition of the respective metal ions(0.2 mmol/L)；white bars:emission intensity of probe 1 on addition of the respective competing ions(0.2 mmol/L) and Hg2+ or Ag+(0.2 mmol/L)；λex/λem=350 nm/475 nm

2.2 熒光光譜滴定

考察了探針1對(duì)Hg2+、Ag+的信號(hào)響應(yīng)情況。向探針1(10 μmol/L，H2O)溶液中分別加入不同濃度的Hg2+或Ag+，發(fā)現(xiàn)隨著體系中Hg2+或Ag+濃度的增加，475 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低。推測(cè)Hg2+或Ag+與探針1配位時(shí)發(fā)生了反向光致電子轉(zhuǎn)移(Reverse PET)過(guò)程，導(dǎo)致熒光猝滅。在加入大約10 μmol/L的Hg2+后光譜趨于穩(wěn)定，表明探針1與 Hg2+可能以1∶1的方式配位結(jié)合(圖4A，內(nèi)插下圖)。然而加入大約5 μmol/L的Ag+后光譜趨于穩(wěn)定，表明探針1與Ag+可能是以2∶1方式配位結(jié)合的(圖4B，內(nèi)插下圖)。通過(guò)等摩爾連續(xù)變化法(Job's-Plot)(圖4，內(nèi)插圖上圖)也得到探針1與Hg2+及Ag+的結(jié)合比分別為1∶1和2∶1，與滴定實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。

2.3 比色法檢測(cè)Hg2+及Ag+

利用探針可對(duì)Hg2+和Ag+的熒光猝滅識(shí)別性能進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的比色檢測(cè)。于365 nm紫外燈下，向探針1(10 μmol/L，H2O)中分別加入 0、5、10、15 μmol/L的 Hg2+，或分別加入 0、2.5、5、10 μmol/L 的 Ag+，通過(guò)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，隨著離子濃度的增大，探針溶液明亮的藍(lán)色熒光逐漸減弱，直至消失(圖5)。這表明探針1能通過(guò)目視比色法定性和半定量檢測(cè) Hg2+和Ag+。由于當(dāng)Hg2+、Ag+的濃度別為5、2.5 μmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了下降，故該法對(duì)Hg2+、Ag+檢出限分別為5、2.5 μmol/L。

2.4 探針1檢測(cè)Hg2+及Ag+的分析參數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)

線性范圍和檢出限是探針定量檢測(cè)的重要指標(biāo)[21]。如圖4所示，隨著體系中Hg2+或Ag+濃度的增加，475 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低。結(jié)果顯示探針1檢測(cè)Hg2+的線性范圍為9.0×10-7～1.1×10-5mol/L，以Hg2+濃度為x軸，熒光強(qiáng)度為y軸進(jìn)行線性擬合，得到校正曲線方程為y=-635.9x+677.7(r2=0.995 3，n=11)；同樣得到檢測(cè)Ag+的線性范圍為8.0×10-7～7.0×10-6mol/L，校正曲線方程為y=-605.1x+653.0(r2=0.991 9，n=7)。利用檢出限公式(LOD=3σ/s，式中σ為測(cè)定10次空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s為校正曲線的斜率)得到探針1檢測(cè)Hg2+和Ag+的檢出限為分別為1.06×10-8、1.11×10-8mol/L。我國(guó)飲用水對(duì)Hg2+、Ag+的限量要求分別為0.5×10-8、5.0×10-7mol /L[22]，探針1對(duì)Hg2+的檢出限略高于此值，而對(duì)Ag+的檢出限低于限量要求。我國(guó)污水綜合排放對(duì)Hg2+、Ag+的限量要求依次為2.0×10-7、5.0×10-6mol/L[23]，探針1檢測(cè)該兩種離子的檢出限可滿足該要求。本文構(gòu)建的探針與其它報(bào)道相比，具有檢出限低和能在純水介質(zhì)中檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)(表1)。

等溫量熱滴定實(shí)驗(yàn)顯示，探針1與Hg2+和Ag+的作用均為吸熱過(guò)程，作用的Ka值依次為6.02×105、1.04×106M-1，計(jì)算得出探針1與上述兩種離子的摩爾結(jié)合自由能ΔG°(ΔH°-TΔS)分別為-29.93、-33.52 kJ/mol，表明識(shí)別過(guò)程自發(fā)進(jìn)行。

表1 本文工作與其它報(bào)道比較Table 1 Comparison of this work with other literature examples

2.5 探針1檢測(cè)Hg2+及Ag+的作用機(jī)理

通過(guò)核磁滴定實(shí)驗(yàn)考察了探針1分子識(shí)別Hg2+和Ag+的作用機(jī)理。因探針1在水中溶解的最大濃度達(dá)不到該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)要求，故選擇在 DMSO-D6溶劑條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從探針1(1 mmol/L)與Ag+的1H NMR滴定譜圖(圖6)中觀察到，隨著Ag+的加入，位于吡啶基團(tuán)上的H9質(zhì)子峰明顯向高場(chǎng)位移(Δδ=-0.09 ppm)，而位于菲啰啉基團(tuán)上的H2質(zhì)子峰卻向低場(chǎng)位移(Δδ=0.04 ppm)，這可能是由于羰基氧原子上的孤對(duì)電子被Ag+所吸引從而使吡啶基團(tuán)的電負(fù)性增強(qiáng)，而這種電負(fù)性變化通過(guò)共軛體系傳導(dǎo)進(jìn)而使菲啰啉基團(tuán)上的電子云密度減小。由此說(shuō)明探針1上的羰基氧原子為Ag+提供了作用位點(diǎn)(圖7)，該過(guò)程引發(fā)了反向光致電子轉(zhuǎn)移(Reverse PET)，使共軛體系上的電子以非輻射躍遷的方式回到基態(tài)，致使探針?lè)肿拥臒晒獍l(fā)生猝滅。探針1(1 mmol/L)與Hg2+的1H NMR滴定譜圖也觀察到類似的現(xiàn)象，說(shuō)明Hg2+也與羰基氧原子配位(圖7)，引發(fā)了Reverse PET過(guò)程，不同的是Ag+與兩個(gè)探針?lè)肿咏Y(jié)合而Hg2+只與一個(gè)探針?lè)肿咏Y(jié)合。

圖6 探針1(1 mmol/L)隨著Ag+濃度增加的局部 1H NMR圖( DMSO-D6，298 K)Fig.6 Partial 1H NMR spectra of probe 1 with the increase of Ag+ concentrations( DMSO-D6，298 K)

圖7 探針1對(duì)Ag+和Hg2+識(shí)別機(jī)理猜想Fig.7 Plausible recognition mechanism of the probe 1 towards Ag+ and Hg2+

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了一種新型水溶性菲啰啉熒光探針，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行考察。在純水介質(zhì)中，探針1通過(guò)熒光猝滅方式識(shí)別Hg2+和Ag+，結(jié)合比分別為1∶1和2∶1，檢測(cè)的線性范圍依次為9.0×10-7～1.1×10-5、8.0×10-7～7.0×10-6mol/L，檢出限均低至10-8mol/L。利用探針1與Hg2+和Ag+的作用模式不同可以對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。根據(jù)識(shí)別前后的熒光強(qiáng)度變化，建立了裸眼快速檢測(cè)Hg2+和Ag+的可視化分析方法。等溫量熱滴定實(shí)驗(yàn)顯示，探針1與Hg2+和Ag+作用的Ka值分別為6.02×105、1.04×106M-1。通過(guò)1H NMR滴定探討了探針1檢測(cè)Hg2+和Ag+的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)離子與探針?lè)肿拥聂驶踉优湮?，引發(fā)了Reverse PET過(guò)程。該研究為探針1在生物體及環(huán)境領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用提供了參考依據(jù)。