離子液體修飾的磁性類沸石咪唑酯骨架材料在藻毒素分析中的應用

吳怡秋，高仕謙，李小蒙，張占恩,2*

(1.蘇州科技大學 環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州科技大學 江蘇省水處理技術與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215000)

近年來，世界各地藍藻暴發(fā)頻率迅速增加，已成為國內外普遍關注的環(huán)境問題[1]。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由藍藻和綠藻水華產生的一類具有環(huán)七肽結構的致癌毒素，長期攝入會引起肝細胞腫脹、壞死，甚至會發(fā)展成肝癌[2-3]。在已鑒定的80余種不同結構MCs中，MC-RR和MC-LR是最常見的兩種類型[4]。由于MCs的中毒事件時有發(fā)生，世界衛(wèi)生組織(WHO)及我國《飲用水水質標準》均將生活飲用水中MC-LR的濃度上限定為1 μg/L[5-6]。由于水體中MCs的濃度通常較低，常用的前處理方法有固相萃取(SPE)[7-8]、在線固相萃取(Online-SPE)[9]及磁性固相萃取(MSPE)[10]，其中MSPE由于操作簡便、萃取時間短以及洗脫溶劑用量少等優(yōu)點而得到廣泛使用[11-12]。目前測定MCs的方法主要有酶聯免疫分析法(ELISA)[13]、高效液相色譜法(HPLC)[14]以及液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[15-16]，其中液相色譜-串聯質譜法因具有較高的選擇性及靈敏度等特點，已廣泛應用于MCs的測定。

離子液體(Ionic liquid，IL)是一類新型綠色溶劑，具有溶解能力強、熱穩(wěn)定性好、不揮發(fā)等特點，對各種有機化合物及金屬離子均有良好的萃取性能[17]。ZIF-8作為金屬有機骨架材料 (Metal organic frameworks,MOFs)的一個重要分支，是一種優(yōu)良的吸附材料，具有合成簡便、熱穩(wěn)定性好以及比表面積高等優(yōu)點。本文通過在磁性M/ZIF-8納米微球表面負載離子液體進行功能化修飾，制備了IL@M/ZIF-8磁性納米材料。在與離子液體的結合過程中，M/ZIF-8的晶體結構可基本保持不變，而IL@M/ZIF-8兼具與微囊藻毒素的氨基和羧基形成靜電相互作用位點的咪唑基。本文將該種具有特異選擇性和較強富集能力的磁性材料作為固相萃取吸附劑用于富集水樣中的MCs，并結合UPLC-MS/MS進行定性定量分析，建立了一種操作簡便、綠色環(huán)保、選擇性好、靈敏度高的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜儀 (美國Dionex公司)、TSQ Quantum Ultra EMR 三重四極桿質譜檢測器(美國Thermo公司)；Nicolet-6700傅立葉轉換紅外光譜分析儀(美國Thermo公司)；DC-12型氮吹儀(上海安普公司)；DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；JJ-1精密增力電動攪拌器(金壇市科析儀器有限公司)。

MC-LR、MC-RR標準溶液(純度大于95%，美國Standford Chemicals公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；甲酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；溴代1-丁基-3-甲基咪唑 ([Bmim]Br,上海成捷化學有限公司)；異丙醇、無水乙醇、FeCl3·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、2-甲基咪唑、氨水、NaCl、丙酮、乙二醇、無水醋酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為美國Millipore公司Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 混合標準溶液的配制

MC-LR和MC-RR的原液濃度為100.0 mg/L，精確移取一定體積,甲醇溶解定容后配制成50 mg/L的混合儲備液，移取200 μL 50 mg/L的儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后配制成1 mg/L的混合標準溶液，密封儲存于4 ℃冰箱中。使用前稀釋成一系列濃度的標準溶液。

1.3 色譜-質譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：Zoxbax Eclipse XDB-C18反相色譜柱 (50 mm×3 mm，1.8 μm，美國Agilent公司)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：A為甲醇，B為1‰甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～3 min，5%～95%A；3～4.5 min，95%～100%A；4.5～5 min，100%A；5～8 min，100%～5%A。

1.3.2 質譜條件離子源：電噴霧電離源(ESI+)；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣壓力：241 kPa；輔助氣壓力：103 kPa；碰撞氣壓力：0.2 Pa；質譜分析參數如表1所示。

表1 2種MCs的質譜分析參數及保留時間Table 1 MS/MS parameters and retention times of two MCs

*quantitative ion

1.4 磁性納米材料的制備

1.4.1 Fe3O4磁性粒子的制備準確稱取6.74 g FeCl3·6H2O分散在125 mL乙二醇中，攪拌均勻生成黃色透明溶液后加入14.37 g無水醋酸鈉，繼續(xù)攪拌至混合均勻，將上述混合溶液轉至200 mL高壓反應釜中，在200 ℃下反應8 h。得到的Fe3O4于60 ℃下真空干燥8 h，研磨備用。

1.4.2 Fe3O4@ZIF-8磁性復合微球的制備將1.8 g Fe3O4加至100 mL 0.3%的聚苯乙烯磺酸鈉水溶液中超聲15 min，收集后用水洗滌3次，然后將其加入含有140 mL甲醇、4.93 g 2-甲基咪唑和2.23 g Zn(NO3)2·6H2O的混合溶液中，在45 ℃下攪拌3 h。收集并洗滌后于60 ℃下真空干燥12 h，研磨備用。

1.4.3 IL@M/ZIF-8磁性納米粒子的制備將0.5g [Bmim]Br加至50 mL丙酮中超聲至完全溶解，加入2 g M/ZIF-8，在30 ℃下攪拌至丙酮完全揮發(fā)，洗滌至近中性后于105 ℃下真空干燥12 h，研磨備用。

1.5 樣品前處理方法

準確稱取50 mg IL@M/ZIF-8于100 mL水樣中振蕩15 min，用鐵銣硼磁鐵收集磁性納米粒子，棄去上清液。用1.5 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶1)渦旋洗脫1 min，重復洗脫2次后收集洗脫液。將洗脫液用N2吹干，用1 mL初始流動相復溶，經0.22 μm有機濾膜過濾后，UPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 材料的表征

通過掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對所合成材料的表面形態(tài)進行表征。圖1A為水熱法合成的Fe3O4磁性粒子的SEM圖，其呈現規(guī)則的球形，表面粗糙，粒徑在400 nm左右。圖1B、C分別為IL@M/ZIF-8的SEM和TEM圖，IL@M/ZIF-8材料的核心為黑色的Fe3O4球體，外層包裹了IL和ZIF-8。IL@M/ZIF-8材料表面有大量褶皺，從而增大了比表面積，提供了更多吸附位點。

圖1 Fe3O4的掃描電鏡圖(A)及IL@M/ZIF-8的掃描電鏡(B)、透射電鏡圖(C)Fig.1 SEM image of Fe3O4(A),SEM(B) and TEM(C) images of IL@M/ZIF-8

圖2 Fe3O4、Fe3O4@ZIF-8、IL@M/ZIF-8及IL的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of Fe3O4,Fe3O4@ZIF-8,IL@M/ZIF-8 and IL

進一步采用傅立葉紅外光譜(FT-IR)對材料表面的分子結構進行表征。如圖2所示，580 cm-1處的特征峰為Fe3O4的Fe—O—Fe彎曲振動吸收峰；1 088 cm-1處的特征峰為IL的C—Br伸縮振動峰；1 167 cm-1處為咪唑環(huán)的伸縮振動峰；1 339 cm-1附近為甲基C—H的變形振動峰；1 421 cm-1和1 584 cm-1附近為咪唑環(huán)的骨架振動峰；2 930 cm-1處為咪唑環(huán)上的C—H伸縮振動峰。紅外譜圖顯示，咪唑基團同時存在于IL和ZIF-8上，該基團可與微囊藻毒素的氨基和羧基之間通過靜電吸引力而相互結合，從而達到富集的目的。

圖3 溶液pH值(A)和IL@M/ZIF-8用量(B)對吸附效率的影響Fig.3 Effect of solution pH value(A)and IL@M/ZIF-8 amount(B)on adsorption efficiency

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 水樣pH值的選擇水樣的pH值會影響目標物的化學性質和吸附劑表面電荷的密度和類型，因此選擇合適的pH值十分重要?？疾炝瞬煌琾H值(1.0～8.0)對目標物回收率的影響(圖3A)，結果表明，隨著pH值的增大，MC-RR和MC-LR的回收率逐漸增大，當pH 4.0時，2種MCs的回收率達到最大值(約78%)，此時MCs和吸附劑間的靜電吸引力最大；隨著pH值的繼續(xù)增大，回收率逐漸降低。因此選擇水樣的最佳pH值為4.0。

2.2.2 IL@M/ZIF-8用量的選擇稱取不同質量(30、40、50、60、70、80 mg)的IL@M/ZIF-8加入100 mL 1 μg/L 的MCs溶液中，考察了吸附劑用量對回收率的影響。如圖3B所示，當IL@M/ZIF-8投加量在30～50 mg之間時，隨著投加量的增加，回收率顯著提高；當投加量達到50 mg時，回收率接近90%；繼續(xù)增加投加量至80 mg，回收率反而有所下降。因此實驗選擇50 mg作為IL@M/ZIF-8的最佳用量。

2.2.3 萃取時間的選擇萃取時間是磁性固相萃取技術中的重要參數之一，要在保證較高萃取效率的前提下盡量縮短萃取時間。分別考察了不同振蕩時間 (3、5、10、15、20、30 min)下的萃取效率，當振蕩時間小于5 min時，材料對MC-RR和MC-LR的萃取效率較低；之后隨著振蕩時間的增加而增加，當振蕩時間達到15 min時，回收率達到最大值，此時藻毒素的吸附達到平衡；進一步延長振蕩時間，MC-RR和MC-LR的回收率均變化不大。因此，實驗選擇15 min作為最佳萃取時間。

2.2.4 洗脫條件的選擇洗脫溶劑的種類和用量均是影響MSPE萃取效率的重要因素?？疾炝?種單相洗脫溶劑(甲醇、丙酮、乙腈和異丙醇)對MC-RR和MC-LR的洗脫效果，實驗結果并不理想。由于溶液的酸度也會影響藻毒素的洗脫效果，繼而分別考察4種單相脫溶劑和甲酸混合而成兩相洗脫溶劑時的洗脫效果，其中以乙腈-0.1%甲酸水溶液兩相洗脫溶劑對藻毒素的洗脫效果最佳，進一步考察不同體積比(1∶3、1∶1、3∶1、9∶1)乙腈-0.1%甲酸水溶液的洗脫效果，結果顯示體積比為3∶1的乙腈-0.1%甲酸水溶液效果最佳。

為了確定洗脫溶劑乙腈-0.1%甲酸水溶液 (3∶1)的用量，分別考察不同體積 (0.6、1.5、3.0、3.5、4.5、6.0 mL)洗脫溶劑的萃取效果。結果顯示，在0.6～3.0 mL之間，隨著洗脫溶劑體積的增加，萃取效率顯著提高，當體積達到3.0 mL時，萃取效果達到最佳，之后繼續(xù)增大洗脫溶劑體積，洗脫效果變化不明顯。因此，綜合考慮選擇最佳洗脫溶劑體積為3.0 mL。

2.3 方法評價

2.3.1 線性關系、定量下限與檢出限配制濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 μg/L的MCs標準溶液，在上述最優(yōu)條件下進行樣品前處理，并在確定的色譜-質譜條件下測定，以峰面積(Y)和質量濃度(X，μg/L)繪制標準工作曲線。結果顯示，MC-RR在0.01～5 μg/L濃度范圍內，MC-LR在0.05～5 μg/L濃度范圍內呈良好線性，線性系數分別為0.999 5和0.999 3。MC-RR和MC-LR的檢出限(S/N=3)分別為1.98 ng/L和3.94 ng/L，定量下限(S/N=10)分別為6.52 ng/L和12.98 ng/L。由于常規(guī)檢測MCs的方法檢出限為0.05～10 μg/L[18-21]，本方法的檢出限比已有方法的最低值(0.05 μg/L)低1個數量級，具有更高的靈敏度。圖4為質量濃度為1 μg/L的2種MCs標準溶液的色譜圖。

2.3.2 回收率與精密度在空白水樣中加入3個濃度水平 (0.1、1、5 μg/L)的MC-RR和MC-LR標準溶液，按最優(yōu)MSPE方法進行處理，每個水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結果顯示，空白水樣中2種MCs的加標回收率為90.3%～98.2%，RSD為2.6%～6.3%，方法的精密度與準確度滿足測定要求。

2.4 與IL@Fe3O4和ZIF-8@Fe3O4的對比

分別考察了IL@M/ZIF-8、IL@Fe3O4及ZIF-8@Fe3O4對0.2 μg/L MCs的回收率。結果顯示，IL@M/ZIF-8對MC-LR和MC-RR的回收率分別為(90.8±4.3)%和(94.9±3.7)%，IL@Fe3O4的回收率分別為(83.6±2.9)%和(86.2±5.2)%，ZIF-8@Fe3O4的回收率分別為(87.4±3.2)%和(88.2±4.8)%。IL@Fe3O4和ZIF-8@Fe3O4的回收率雖能達到83%以上，但單種材料對Fe3O4的修飾效果有限，而復合修飾材料IL@M/ZIF-8可得到更高的回收率。此外，由于具有更大的比表面積和更多的吸附點位，IL@M/ZIF-8材料的用量(50 mg)以及達到吸附平衡的時間(15 min)比IL@Fe3O4(95 mg，35 min)和ZIF-8@Fe3O4(80 mg，25 min)大幅度減少，減少了材料用量并提高了萃取效率和分析性能。

2.5 方法的應用

采集太湖水域3個點位的水樣，經0.45 μm濾膜過濾后，采用基于 IL@M/ZIF-8材料建立的方法對MC-LR和MC-RR進行萃取，用UPLC-MS/MS進行檢測，每個水樣平行測定6次，同時，對水樣進行0.5 μg/L和2 μg/L兩個濃度水平的加標回收率實驗，每個濃度平行測定6次。結果如表2所示，在未加標情況下，1#點位未檢測出MCs，2#和3#點位檢出MC-RR的濃度分別為0.233 μg/L和0.172 μg/L；在加標情況下，3個點位檢測濃度為0.442～2.418 μg/L，回收率達88.5%～108%，RSD為1.5%～7.2%，研究結果表明該方法具有實際可操作性，適用于環(huán)境水樣中痕量MCs的測定。

表2 太湖水樣中2種MCs在不同加標水平下的回收率(n=6)Table 2 Recoveries of two MCs from water samples in Taihu at different spiked levels(n=6)

*:no detected; **:no data

2.6 與其他方法的比較

為了評估本方法的萃取和分析性能，將其分析參數與已有方法進行對比。如表3所示，在同樣檢測方法 (HPLC-MS/MS)的前提下，與表中所列的幾種預處理方法 (SBSE[19]，SPE[20]，Online-SPE[9]，MSPD[21])對MC-LR的萃取效率進行比較。結果顯示，本方法得到的LOD (0.004 μg/L)最低，且遠低于《飲用水水質標準》規(guī)定的檢出限 (1 μg/L)[6]。此外，本方法的萃取和分析時間也均少于其他方法，在萃取和分析效率方面具有較大優(yōu)勢。

表3 本方法與其它方法對MC-LR萃取的比較Table 3 Comparison of this method with other methods for extraction of MC-LR

*no data

3 結 論

本研究建立了以IL@M/ZIF-8為磁性固相萃取吸附劑，以UPLC-MS/MS為檢測手段分析測定水樣中痕量MC-LR和MC-RR的方法，并取得了良好的分析效果。該方法具有操作簡單、靈敏度高、分析速度快、有機溶劑消耗少，以及精密度和重現性較好等優(yōu)點，在MCs分析方面具有良好的應用前景。