丙泊酚通過下調(diào)BNIPL-2抑制結(jié)腸癌增殖的研究

薛震宇 張磊 姜虹

結(jié)腸癌的發(fā)病率每年都在持續(xù)增加。2015年，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在中國所有惡性腫瘤中排名第五［1］。結(jié)腸癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，每年大約有140萬的新發(fā)病例，并且2012年死亡人數(shù)將近70萬［2］。雖然目前臨床上已有的治療手段包括手術(shù)、化療和分子靶向治療等，在一定程度上改善了患者的生活質(zhì)量，但整體而言結(jié)腸癌患者的預(yù)后仍然較差［3］。因此，迫切需要開發(fā)更有效的治療方法。

腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲在癌癥轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。BNIPL-2（Bcl-2 /腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白-2）可與Cdc42GAP相互作用并抑制Cdc42GAP 對Cdc42的GAP活性［4］。Rho家族的GTP酶Cdc42可以控制肌動蛋白細(xì)胞骨架的動力學(xué)［5-6］。細(xì)胞遷移與肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組相關(guān)，并引發(fā)細(xì)胞形態(tài)的改變。說明BNIPL-2的過表達(dá)可能增加細(xì)胞侵襲并促進(jìn)細(xì)胞遷移。

丙泊酚（2，6-二異丙基苯基）是麻醉誘導(dǎo)和維持期間廣泛使用的藥劑。最近的發(fā)現(xiàn)表明，麻醉可以在圍手術(shù)期誘發(fā)代謝、炎癥和免疫學(xué)變化［7］。最近已經(jīng)揭示丙泊酚通過抑制細(xì)胞活力和癌細(xì)胞的侵襲能力對一些惡性腫瘤發(fā)揮抗腫瘤作用［8-9］。然而，其對癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚不清楚。因此，在本研究中，我們使用SW480結(jié)腸癌細(xì)胞研究了丙泊酚對癌細(xì)胞增殖作用的影響，并探討了其潛在機(jī)制。

資料與方法

一、研究對象

應(yīng)用TCGA分析BNIPL-2表達(dá)差異和相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組譜的臨床結(jié)腸癌樣本中BNIPL-2相關(guān)調(diào)控信號通路，來源于TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）。

根據(jù)BNIPL-2的表達(dá)水平，對患者進(jìn)行分組，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。為了檢測臨床惡性腫瘤階段，相關(guān)信號傳導(dǎo)，CRC患者存活率和BNIPL-2表達(dá)之間的關(guān)系，我們以BNIPL-2表達(dá)水平的中位數(shù)為分界線將CRC組織分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。BNIPL-2表達(dá)高于中位數(shù)的患者被分為高表達(dá)組。BNIPL-2表達(dá)低于中位數(shù)的患者分為低表達(dá)組。

二、細(xì)胞實驗

（一）細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞模型

從本院中心實驗室獲得的CRC細(xì)胞系SW480，在含有10% FBS（Gibco公司，美國）的DMEM（Hyclone公司，美國）中培養(yǎng)。將細(xì)胞在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。丙泊酚干預(yù)細(xì)胞，在麻醉維持期間，丙泊酚的濃度范圍為5至50 μM［10］。在該研究中，丙泊酚分別以濃度梯度（1，5，10，20 μg/mL）施用于細(xì)胞4 h。從SW480細(xì)胞中分離總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（Takara，Japan） 合 成cDNA。 從cDNA擴(kuò) 增BNIPL-2 mRNA的CDS序列并插入Fugw載體。通過使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher公司，美國）將載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

（二）CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將處于對數(shù)生長期的SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞用胰酶消化后，以5×103個/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入DMSO和不同濃度的丙泊酚（濃度分別為1，5，10，20 μg/mL），37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8檢測試劑，繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。設(shè)3個復(fù)孔。

（三）qRT-PCR

使用RNAiso Plus（TaKaRa公司，日本）根據(jù)說明書從CRC細(xì)胞中分離總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司，美國）將總共1 μg RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用SYBR Green（Enzynomics公司，韓國）分析相對基因表達(dá)。進(jìn)行實時PCR并使用CFX分析數(shù)據(jù)（Bio-Rad公司，美國）。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。組間的比較用方差分析，組與組之間的比較用LSD-t檢驗。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BNIPL-2在結(jié)腸癌組織中上調(diào)并且與預(yù)后不良相關(guān)

為了檢測BNIPL-2表達(dá)是否與結(jié)腸癌相關(guān)，我們分析了43個正常組織樣本和來自TCGA的459個腫瘤樣本中BNIPL-2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比結(jié)腸癌樣本中BNIPL-2水平顯著上調(diào)（圖1A）。Kaplan-Meier生存曲線用于分析不同水平的BNIPL-2表達(dá)是否與結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)。我們將患者分為兩組，BNIPL-2低表達(dá)和高表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)與高表達(dá)結(jié)腸癌患者相比，BNIPL-2表達(dá)較低的患者擁有較高的存活率。此外，BNIPL-2低表達(dá)患者的5年生存率與BNIPL-2高表達(dá)患者相比生存率顯著提高（圖1B）。

圖1 TCGA分析。1A：與正常組織相比，腫瘤樣本中的BNIPL-2表達(dá)水平較高；1B：BNIPL-2高表達(dá)組的生存率低于低表達(dá)組

二、BNIPL-2的高表達(dá)與CRC的惡性階段相關(guān)

因為BNIPL-2高表達(dá)與預(yù)后不良的關(guān)系，我們假設(shè)BNIPL-2表達(dá)與惡性特征相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)在Ⅳ期患者的BNIPL-2水平表達(dá)較高，而在Ⅱ期和Ⅲ期BNIPL-2的表達(dá)水平較低（圖2A）。我們進(jìn)一步分析了TNM分期，發(fā)現(xiàn)與低表達(dá)組相比，BNIPL-2表達(dá)較高的患者在M1期更多（圖2B）。BNIPL-2的表達(dá)與N分期分類之間沒有顯著差異（圖2C）。然而，T分期分析顯示，與低表達(dá)結(jié)腸癌組織相比，BNIPL-2高表達(dá)的癌組織常處于T4期（圖2D）。

三、BNIPL-2促進(jìn)CRC細(xì)胞系SW480的增殖

我們通過基因集富集分析（GSEA）檢測了與CRC轉(zhuǎn)錄組譜中BNIPL-2表達(dá)相關(guān)的腫瘤發(fā)生和發(fā)育相關(guān)調(diào)控途徑，發(fā)現(xiàn)BNIPL-2高表達(dá)組織中細(xì)胞遷移相關(guān)信號通路被激活。SW480細(xì)胞中BNIPL-2的異位表達(dá)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D，細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P21的表達(dá)（圖3）。

四、丙泊酚對SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用的影響

CCK-8結(jié)果顯示，經(jīng)過濃度分別為1 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL丙泊酚處理4 h后，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖受到明顯抑制，呈濃度依賴性，各濃度組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖4）。提示丙泊酚能抑制SW480細(xì)胞增殖。

五、通過不同濃度的丙泊酚調(diào)節(jié)BNIPL-2基因的表達(dá)

為了闡明丙泊酚抑制CRC細(xì)胞增殖的機(jī)制，通過qRT-PCR分析SW480細(xì)胞中BNIPL-2基因的表達(dá)（P＜0.05，見圖5）。BNIPL-2隨丙泊酚的濃度升高而降低。提示丙泊酚能下調(diào)BNIPL-2的表達(dá)水平。

圖2 BNIPL-2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況。2A：在IV期BNIPL-2表達(dá)水平增高，而在II期和III期BNIPL-2表達(dá)水平較低；2B：與低表達(dá)BNIPL-2的癌組織相比，BNIPL-2高表達(dá)的癌組織在M1更多；2C：BNIPL-2的表達(dá)與N分期分類之間沒有顯著差異；2D：與低表達(dá)結(jié)腸癌組織相比，BNIPL-2高表達(dá)的癌組織常處于T4期

圖3 qRT-PCR檢測細(xì)胞周期蛋白。qPCR顯示SW480細(xì)胞中BNIPL-2上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1，細(xì)胞周期蛋白E1的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P21的表達(dá)

討 論

丙泊酚作為最廣泛使用的靜脈麻醉藥之一，在臨床麻醉中被廣泛應(yīng)用于成年人、兒童、老人等手術(shù)中并發(fā)揮了多重優(yōu)勢［10-11］。除了麻醉效果外，異丙酚還具有多種非麻醉作用，如神經(jīng)保護(hù)［12］，抗氧化［13］，抗焦慮［14］和抗腫瘤［15-16］等。

在本研究中，我們使用了從TCGA獲得的459名腫瘤患者和43名對照患者，并將它們分為低BNIPL-2和高NIPL-2表達(dá)組。Kaplan-Meier曲線分析表明，BNIPL-2高表達(dá)與結(jié)腸患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。在結(jié)腸癌組織中BNIPL-2上調(diào)并且與預(yù)后不良相關(guān)。

之后，本研究提供了證據(jù)表明丙泊酚對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力與丙泊酚濃度呈負(fù)相關(guān)。隨著丙泊酚的濃度升高，腫瘤細(xì)胞的增殖能力顯著下降。同時丙泊酚可以調(diào)節(jié)BNIPL-2的水平降低，q-PCR分析表明丙泊酚呈濃度依賴性抑制BNIPL-2的表達(dá)水平。我們在體外細(xì)胞模型中證實了這些結(jié)果。以前的研究表明丙泊酚可以減少許多癌癥的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，包括結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌［17-21］。然而，丙泊酚在癌細(xì)胞中是否通過BNIPL-2的作用仍然知之甚少。在這項研究中，我們證明了這一點。我們的數(shù)據(jù)還證實丙泊酚以劑量依賴性方式降低SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性。

綜上，本研究進(jìn)一步探討了丙泊酚通過下調(diào)BNIPL-2的表達(dá)對結(jié)腸癌患者的生存率的改善，并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用。故認(rèn)為BNIPL-2參與并調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。但目前確切的作用機(jī)制與信號通路等問題仍將進(jìn)一步研究。

圖4 CCK-8檢測不同濃度丙泊酚對細(xì)胞增殖的影響；表明經(jīng)過濃度分別為1，5，10，20 μg/mL丙泊酚處理，SW480細(xì)胞增殖受到明顯抑制，呈濃度依賴性

圖5 qRT-PCR分析SW480細(xì)胞中BNIPL-2基因的表達(dá)。表明BNIPL-2 表達(dá)水平隨丙泊酚的濃度呈依賴性下降