枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CS27液體發(fā)酵條件優(yōu)化

張慧 林陳強(qiáng) 吳大華 陳濟(jì)琛 蔡海松

摘? 要? 從提高細(xì)胞生物量并降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的目的出發(fā)，本文采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，對(duì)已篩選出的枯草芽孢桿菌CS27菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件優(yōu)化。得到最佳培養(yǎng)基配方為：1.5%黃豆粉、0.5%糖蜜、0.8%氯化銨、1.0%氯化鈉、0.1%檸檬酸鈉、0.5%碳酸鈣、0.1%七水合硫酸鎂;最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度32 ℃，最佳裝液量50 mL/250 mL，最適接種量10%，初始pH 7.0。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵條件下細(xì)胞生物量可以達(dá)到1.75×109 cfu/mL，為枯草芽孢桿菌CS27菌株規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 枯草芽孢桿菌;發(fā)酵條件優(yōu)化;微生物菌劑;氮源;碳源;無(wú)機(jī)鹽

中圖分類號(hào)? S182? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? The fermentation medium and culture conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments. The optimum fermentation medium was 1.5% soybean powder， 0.5% molasses， 0.8% ammonium chloride， 1.0% NaCl， 0.1% sodium citrate， 0.5% calcium carbonate， 0.1% MgSO4·7H2O. The optimum fermentation conditions were fermentation temperature 32 ℃， liquid volume 50 mL / 250 mL， inoculation amount 10%， initial pH value 7.0. The cell biomass could reach 1.75 × 109 cfu/mL under the optimized fermentation medium， which could provide a scientific basis for the large scale production and application of B. subtilis CS27.

Keywords? Bacillus subtilis; fermentation conditions optimization; microbial fungicide; carbon source; nitrogen source; inorganic salt

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.023

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布允許使用的15種微生態(tài)制劑菌種之一，已經(jīng)越來(lái)越多的被研制成微生物制劑[1-3]，應(yīng)用于飼料主要有以下幾方面的作用：保持腸道菌群正?；?抑菌、殺菌作用;抑制腸毒素;防止產(chǎn)生有害物質(zhì)-氨和胺;免疫刺激作用等。其制劑是無(wú)毒、無(wú)污染的環(huán)保產(chǎn)品，具有廣闊的發(fā)展前景，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)，顯示出巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益和生態(tài)效益[4-6]。已有一些芽孢桿菌液體發(fā)酵條件優(yōu)化的相關(guān)研究，如枯草芽孢桿菌[7]、解淀粉芽孢桿菌[8]、納豆芽孢桿菌[9]等，但針對(duì)枯草芽孢桿菌應(yīng)用于飼用微生物菌劑方面進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究還較少。

實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)枯草芽孢桿菌大多選用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等價(jià)格偏高的原料作為培養(yǎng)基配方，不適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。本文以實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的枯草芽孢桿菌CS27作為出發(fā)菌株研制飼用的微生物菌劑，以降低發(fā)酵生產(chǎn)成本為目的，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，對(duì)CS27菌株的液體培養(yǎng)基和工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，為更高層次的發(fā)酵水平及生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)菌株? 枯草芽孢桿菌CS27由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所分離保存，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定。

1.1.2? 試驗(yàn)試劑? 蛋白胨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、牛肉膏、碳酸鈣、氯化銨、檸檬酸鈉，均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。黃豆粉和糖蜜由福建省華龍飼料有限公司提供。

1.1.3? 試驗(yàn)儀器? SKY-200B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-1FD型無(wú)菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.1.4? 培養(yǎng)基? 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基[10]：1.0%蛋白胨，0.5%氯化鈉，2.0%瓊脂，0.3%牛肉膏， pH 7.0。種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏10 g，氯化鈉5 g，pH 7.0?；A(chǔ)培養(yǎng)基：1%黃豆粉，1%糖蜜，pH 7.0。

1.2? 方法

1.2.1? 種子液的制備? 活化枯草芽孢桿菌株，斜面刮取二環(huán)接入50 mL液體種子培養(yǎng)基，在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h，制備種子液。

1.2.2? 發(fā)酵菌數(shù)測(cè)定? 取1 mL發(fā)酵液加入到9 mL無(wú)菌水中，依次做10倍梯度稀釋，選取兩個(gè)適當(dāng)?shù)奶荻认♂尡稊?shù)，吸取0.1 mL涂平板，每個(gè)梯度3次重復(fù)。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，選取30～300的培養(yǎng)皿計(jì)菌落數(shù)[10]。

1.2.3? 單因素試驗(yàn)? （1）碳源。以1%大豆蛋白胨為氮源，分別添加1%糖蜜、葡萄糖、蔗糖、玉米粉、玉米淀粉、麥芽糖為碳源，CK為不加任何碳源的1%大豆蛋白胨（CK1）。按10%的接種量，將種子液接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，搖床震蕩培養(yǎng)（溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min）24 h后，稀釋涂布測(cè)活菌數(shù)（下同），檢測(cè)碳源對(duì)CS27生長(zhǎng)的影響。

（2）有機(jī)氮源。保持1%最佳碳源不變，分別用1%的牛肉膏、大豆蛋白胨、豆粕、蛋白胨、黃豆粉、酵母粉， CK為1%糖蜜（CK2）。按照上述條件接種培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞生物量，測(cè)定有機(jī)氮源對(duì)CS27生長(zhǎng)的影響。

（3）無(wú)機(jī)氮源。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.5%的硝酸鉀、硫酸銨、脲、硝酸銨、草酸銨，CK為1%黃豆粉、1%糖蜜（CK3）。按照上述條件接種培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞生物量，測(cè)定無(wú)機(jī)氮源對(duì)CS27生長(zhǎng)的影響。

（4）無(wú)機(jī)鹽。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基（1%的糖蜜、1%黃豆粉）中分別添加0.1%的磷酸二氫鉀、七水合硫酸亞鐵、氯化鈣、七水合硫酸鋅、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉、碳酸鈣、七水合硫酸鎂，CK為不加無(wú)機(jī)鹽的1%的糖蜜、1%黃豆粉。按照上述條件接種培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞生物量，測(cè)定無(wú)機(jī)鹽對(duì)CS27生長(zhǎng)的影響。

（5）最佳濃度試驗(yàn)。將確定好的碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽分別按照一定的濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，其他成分不變。按照上述條件接種培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞生物量，確定CS27生長(zhǎng)的最佳濃度。

1.2.4? 正交試驗(yàn)? 選擇合適的碳源、氮源，在最佳濃度基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交表，3因素3水平安排試驗(yàn)，按照上述條件接種培養(yǎng)后測(cè)定細(xì)胞生物量，確定最佳碳源和氮源組合。在最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽濃度基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表，4因素3水平，按照上述條件接種培養(yǎng)后測(cè)定細(xì)胞生物量，確定最佳無(wú)機(jī)鹽組合。

1.2.5? 發(fā)酵條件優(yōu)化? 用優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定不同接種量、溫度、初始pH、黃豆粉目數(shù)和裝液量對(duì)CS27生長(zhǎng)的影響。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 培養(yǎng)基篩選

2.1.1? 不同有機(jī)碳氮源對(duì)CS27細(xì)胞生物量的影響? 由篩選結(jié)果（表1）可以看出，6種碳源中，CS27最易利用糖蜜，細(xì)胞生物量顯著高于其他5種碳源，可選用糖蜜作為培養(yǎng)基的碳源。氮源中，有機(jī)氮源豆粕和黃豆粉發(fā)酵后的細(xì)胞生物量較大，其中黃豆粉發(fā)酵后的細(xì)胞生物量顯著高于豆粕，可以選擇黃豆粉作為培養(yǎng)基的有機(jī)氮源。

2.1.2? 不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)CS27細(xì)胞生物量的影響? 由篩選結(jié)果（表1）可以看出，以硫酸銨、氯化銨作為無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵后的細(xì)胞生物量均高于對(duì)照，以氯化銨作為無(wú)機(jī)氮源時(shí)CS27菌株的細(xì)胞生物量極顯著高于對(duì)照，因此選擇氯化銨作為培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)氮源。

2.1.3? 碳源、氮源最佳濃度對(duì)CS27細(xì)胞生物量的影響? 如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，隨著糖蜜濃度的增加，CS27菌株的細(xì)胞生物量先增大后減小，濃度在1%時(shí)細(xì)胞生物量最大。如圖2所示，黃豆粉濃度在1.5%時(shí)細(xì)胞生物量最大。當(dāng)黃豆粉濃度大于2%時(shí)CS27細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，可能是由于黃豆粉本身的蛋白質(zhì)含量比較高，當(dāng)培養(yǎng)基中含有較高濃度黃豆粉時(shí)，微生物降解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量氨類物質(zhì)使得培養(yǎng)基的pH升高，不利于微生物的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞生物量急劇減少。如圖3所示，氯化銨濃度在1%時(shí)的細(xì)胞生物量最大。

2.1.4? 碳源、氮源正交試驗(yàn)? 以細(xì)胞生物量作為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳碳源、氮源組合。碳源、氮源正交實(shí)驗(yàn)選擇L9（33）正交設(shè)計(jì)表，即以糖蜜（A）、黃豆粉（B）、氯化銨（C）分3水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，從極差R的大小可以看出，黃豆粉是影響CS27細(xì)胞生物量的重要因素，其次是氯化銨和糖蜜，糖蜜是三因素中相對(duì)不重要的因素。綜合分析可知其最佳碳源、氮源組合為：A2B1C3，即1.5%黃豆粉、0.5%糖蜜、0.8%氯化銨。

2.1.5? 無(wú)機(jī)鹽篩選與最佳濃度試驗(yàn)? 由圖5和表3可知，七水合硫酸鎂、檸檬酸鈉、碳酸鈣能夠顯著促進(jìn)CS27的生長(zhǎng)，其中七水合硫酸鎂、檸檬酸鈉達(dá)到極顯著水平，可以選擇這三種無(wú)機(jī)鹽作為培養(yǎng)基的成分。

如圖4所示，氯化鈉濃度對(duì)CS27細(xì)胞生長(zhǎng)的影響很大，當(dāng)培養(yǎng)基氯化鈉濃度為0.8%時(shí)細(xì)胞生物量最大，氯化鈉濃度低于或高于0.8%時(shí)，CS27細(xì)胞的生長(zhǎng)均會(huì)受到不同程度的抑制。如圖5所示，當(dāng)培養(yǎng)基七水合硫酸鎂濃度為0.3%時(shí)細(xì)胞生物量最大，七水合硫酸鎂濃度低于或高于0.3%時(shí)，CS27細(xì)胞生物量都會(huì)有不同程度的降低，說(shuō)明適量的七水合硫酸鎂對(duì)CS27菌株生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，這可能是由于鎂離子是合成微生物新陳代謝一些酶必需的離子。如圖6所示，當(dāng)培養(yǎng)基中檸檬酸鈉濃度為0.1%時(shí)，細(xì)胞生物量最大。如圖7所示，當(dāng)培養(yǎng)基中碳酸鈣濃度為0.5%時(shí)，細(xì)胞生物量最大。

2.1.6? 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)? 以細(xì)胞生物量作為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的無(wú)機(jī)鹽組合，無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)選擇L9（34）正交設(shè)計(jì)表，即以氯化鈉（A'）、七水合硫酸鎂（B'）、檸檬酸鈉（C'）、碳酸鈣（D'）分3 水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析如表4所示。

對(duì)無(wú)機(jī)鹽正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，從極差R的大小可以看出，七水合硫酸鎂是影響CS27細(xì)胞生物量的重要因素，其次是碳酸鈣和檸檬酸銨，氯化鈉是四因素中相對(duì)不重要的因素。綜合分析，最佳無(wú)機(jī)鹽組合為A'2B'1C'2D'3，即0.1%檸檬酸鈉、0.1%七水合硫酸鎂、0.5%碳酸鈣、1.0%氯化鈉。

2.2? 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1? 溫度對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響? 對(duì)CS27菌株分別設(shè)定30、32、34、36 ℃進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)并測(cè)定菌數(shù)。結(jié)果如圖8所示，菌株在32～34 ℃之間發(fā)酵最佳，34 ℃發(fā)酵菌數(shù)略低于32 ℃，在低于32 ℃和超過(guò)34 ℃條件下菌數(shù)明顯下降，因此32 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.2? 初始pH對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響? 對(duì)CS27菌株分別設(shè)定初始pH為5、6、7、8、9五個(gè)梯度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)并測(cè)定菌數(shù)。結(jié)果如圖9所示，發(fā)酵菌數(shù)隨初始pH的增加而增加，在初始pH大于7時(shí)，發(fā)酵菌數(shù)開始下降，由此可見最適初始pH為7。

2.2.3? 裝液量對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響? 在250 mL三角瓶?jī)?nèi)分別按照30、50、70、100、120 mL裝液量進(jìn)行搖床培養(yǎng)并測(cè)定菌數(shù)。結(jié)果如圖10所示，發(fā)酵菌數(shù)隨裝液量的增加而增加，裝液量在50 mL以上時(shí)發(fā)酵菌數(shù)開始下降，因此50 mL為最佳裝液量。

2.2.4? 接種量對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響? 對(duì)CS27菌株分別按照3%、5%、7%、10%、12%的接種量進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)并測(cè)定菌數(shù)。結(jié)果如圖11所示，當(dāng)接種量在3%～7%時(shí)發(fā)酵菌數(shù)基本沒(méi)有變化，接種量大于7%時(shí)菌數(shù)隨接種量的增加而增加，接種量大于10%的情況下菌數(shù)隨接種量的增加而下降，因此可以選擇10%接種量為最佳接種量。

2.2.5? 黃豆粉目數(shù)對(duì)發(fā)酵菌數(shù)的影響? 培養(yǎng)基為1%黃豆粉和1%糖蜜。黃豆粉分別設(shè)定為20、40、60、80目進(jìn)行試驗(yàn)，接種后培養(yǎng)24 h測(cè)定活菌數(shù)，考察不同目數(shù)黃豆粉對(duì)CS27菌株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如圖12所示，黃豆粉的目數(shù)對(duì)CS27的影響較大，過(guò)40目和60目的黃豆粉培養(yǎng)CS27菌株生長(zhǎng)較好，60目的黃豆粉較40目對(duì)CS27菌株生長(zhǎng)的影響更好，所以60目的黃豆粉更適合發(fā)酵生產(chǎn)CS27菌株。

3? 討論

本文所用的菌種枯草芽孢桿菌CS27是由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)酶制劑生產(chǎn)的常用菌種，符合益生菌菌種要求。本實(shí)驗(yàn)室前期的試驗(yàn)已經(jīng)完成了對(duì)CS27菌株的產(chǎn)酶、抑菌和急性毒性等測(cè)試，結(jié)果表明該株枯草芽孢桿菌具有蛋白酶和淀粉酶活性，其代謝產(chǎn)物對(duì)腸道病原菌抑制作用明顯，并且急性毒性實(shí)驗(yàn)安全無(wú)毒副作用[11]。因此枯草芽孢桿菌CS27符合作為益生菌的條件，在開發(fā)飼用微生物菌劑方面具有較大的潛力。

微生物的生長(zhǎng)不僅僅決定于外部條件，內(nèi)部條件也在起作用，微生物的生長(zhǎng)繁殖是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，由內(nèi)外部條件共同決定的[12-15]，不同枯草芽孢桿菌菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件差異很大，因此需要對(duì)特定的菌株篩選適宜的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件。本研究出于降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的考慮，對(duì)枯草芽孢桿菌CS27發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行篩選優(yōu)化。首先在三角瓶中進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分為糖蜜、黃豆粉、氯化銨、檸檬酸鈉、氯化鈉、碳酸鈣、七水合硫酸鎂，采用正交試驗(yàn)對(duì)篩選培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳培養(yǎng)基為0.5%糖蜜、1.5%黃豆粉、0.8%氯化銨、0.1%檸檬酸鈉、1.0%氯化鈉、0.5%碳酸鈣、0.1%七水合硫酸鎂，優(yōu)化后發(fā)酵的細(xì)胞生物量可達(dá)1.75×109 cfu/mL[16]。

磷是微生物生長(zhǎng)必須的元素之一，許多研究已經(jīng)證明培養(yǎng)基中添加一定量磷可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。本文在無(wú)機(jī)鹽篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.1%磷酸二氫鉀和0.1%磷酸氫二鉀搖瓶培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液中的細(xì)胞生物量與對(duì)照組相比顯著減少。相關(guān)報(bào)道中，盧耀俊等[17]發(fā)現(xiàn)向枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中加入2.33 g/L磷酸氫二鈉和0.52 g/L磷酸二氫鈉能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)，除此以外，至今鮮有培養(yǎng)基中加入磷元素抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的相關(guān)報(bào)道。出現(xiàn)上述情況可能存在以下原因：加入培養(yǎng)基中的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的濃度過(guò)低或者過(guò)高;鉀離子對(duì)CS27菌株生長(zhǎng)有一定的抑制作用;有機(jī)氮源黃豆粉中的磷含量比較充分，培養(yǎng)基中磷含量過(guò)高會(huì)抑菌菌株生長(zhǎng)，具體原因還有待研究。

本文通過(guò)搖瓶培養(yǎng)對(duì)枯草芽孢桿菌CS27發(fā)酵條件進(jìn)行研究，確定最佳發(fā)酵條件為;發(fā)酵溫度32 ℃，初始pH 7.0，最適接種量10%，最佳裝液量50 mL ，為后續(xù)枯草芽孢桿菌CS27利用5 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)的發(fā)酵條件優(yōu)化提供了一定的理論依據(jù)。

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