配位自組裝的高效電化學(xué)界面對色氨酸的手性識別

雷 鵬， 周 影， 洪沙沙， 楊亞娟， 雙少敏

(山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原 030006)

手性是大多數(shù)生物分子固有的特性之一，而氨基酸作為組成生命物質(zhì)的基本單元，不同構(gòu)型的氨基酸在生物體內(nèi)發(fā)揮著不同作用[1]。例如，人體所需的蛋白質(zhì)主要是由L-氨基酸參與合成，而D -氨基酸非但不參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，并可能引起嚴(yán)重的副作用[2]。L-色氨酸(L-Trp)是褪黑素和5-羥色胺的蛋白質(zhì)和前體的必需成分，可改善睡眠、情緒和精神健康[3]，當(dāng)人體內(nèi)的L-Trp含量失調(diào)，還會引起多種慢性疾病。目前，L-Trp已經(jīng)被用于安神藥物、食品以及飼料添加劑，而D -Trp屬于非蛋白光學(xué)活性的氨基酸，是抗癌和免疫藥物的重要前驅(qū)物質(zhì)。因此，在生命科學(xué)和其他相關(guān)領(lǐng)域中，構(gòu)建一種用于識別手性Trp對映異構(gòu)體的檢測方法至關(guān)重要。目前，檢測Trp對映異構(gòu)體的技術(shù)主要包括化學(xué)發(fā)光法[4]、高效液相色譜法[5]、熒光微量法[6]和電化學(xué)方法[7]等。與其他方法相比，電化學(xué)方法因具有操作簡單，制備方便，靈敏度高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于氨基酸對映異構(gòu)體的測定[8 - 9]。

為了提高靈敏度，在傳感器中引進(jìn)高性能納米材料已經(jīng)成為研究的熱點，如碳納米管(CNTs)[10]、石墨烯[11]和導(dǎo)電聚合物[12 - 13]。多壁碳納米管(MWCNTs)因其高比表面積，高化學(xué)穩(wěn)定性，優(yōu)異的導(dǎo)電性而被廣泛地用于電化學(xué)研究。此外，MWCNTs和聚合物形成的復(fù)合材料不僅對一些生物分子具有優(yōu)異的電催化能力，而且可以表現(xiàn)出協(xié)同作用[14]。

超分子化學(xué)的發(fā)展為手性化合物的鑒別提供了新的途徑。環(huán)糊精是由七個葡萄糖分子組成的環(huán)狀多糖，可作為形成超分子結(jié)構(gòu)的理想宿主[15 - 16]，且已廣泛用于從生物環(huán)境中選擇性提取手性化合物。由于其親水外表面和疏水內(nèi)腔，它能夠與尺寸合適的分子形成包合物，因此常被用作識別氨基酸對映異構(gòu)體。Ou等[17]以石墨烯量子點-β-環(huán)糊精(GQD/β-CD)復(fù)合材料修飾電極， 利用GQD放大電化學(xué)信號及提高識別效率和β-CD的手性微環(huán)境，成功識別了Trp對映體。Zaidi[18]將β-CD/還原氧化石墨烯(RGO)復(fù)合材料滴凃于電極表面，成功手性識別了苯丙氨酸對映異構(gòu)體。本文將Cu2+配位在β-CD的寬口處，以Cu2+充當(dāng)頂蓋，并且迫使Trp異構(gòu)體通過β-CD的較窄開口進(jìn)入形成氫鍵，從而達(dá)到識別效果。通過循環(huán)伏安法將L-精氨酸聚合到MWCNTs表面，進(jìn)一步將修飾電極浸泡在Cu2+修飾的β-CD中,使其自組裝在電極表面，從而得到Cu-β-CD/PLA/MWCNTs復(fù)合膜，并將其修飾在玻碳電極(GCE)表面，以MWCNTs膜作為基底，PLA、Cu-β-CD作為識別元件，構(gòu)建手性電化學(xué)傳感器，從而對Trp對映異構(gòu)進(jìn)行手性識別和檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；UV-2450分光光度計(日本，島津公司)；TensorⅡ紅外光譜儀(德國，Bruker optics公司)。

L-色氨酸(L-Trp，99%)，D -色氨酸(D -Trp，98%)，L-精氨酸(L-Arg，99%),β-環(huán)糊精(β-CD)，多壁碳納米管(MWCNTs)和CuSO4·5H2O，均購于阿拉丁試劑公司(中國上海)，其他所用試劑均為分析純。所有溶液都用超純水(18.2 MΩ·cm)制備。

1.2 Cu-β -CD的制備

將15 mL 0.04 mol·L-1的CuSO4溶液加至含0.02 mol·L-1β-CD的10 mL NaOH溶液(0.5 mol·L-1)中，有藍(lán)色沉淀Cu(OH)2生成，室溫下持續(xù)攪拌12 h，過濾除去沉淀，在濾液中加入200 mL乙醇，形成藍(lán)色絮狀物。靜止12 h后將其過濾，用乙醇充分洗滌，在真空干燥箱中于25 ℃下干燥后，備用。

1.3 PLA/MWCNTs/GCE的制備

首先對裸玻碳電極(GCE)用1.0、0.3、0.05 μm的Al2O3依次進(jìn)行打磨，進(jìn)一步在無水乙醇和超純水中超聲處理1 min，自然晾干后，取6 μL的MWCNTs(0.6 mg·mL-1)滴涂在GCE表面，紅外燈下烘干，最后用超純水沖洗除去松散吸附的MWCNTs。將MWCNTs/GCE浸泡在含有2.5×10-3mol·L-1L-Arg 的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.0)中，采用循環(huán)伏安法在-1.6～1.8 V電位范圍以100 mV·s-1掃描10圈，取出用超純水淋洗，室溫晾干得到PLA/MWCNTs/GCE。

1.4 Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE的制備

將PLA/MWCNTs/GCE浸泡在含有5.0×10-3mol·L-1Cu-β-CD的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)中20 h，得到Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電極修飾材料的掃描電鏡(SEM)表征

圖1A、1B和1C分別是MWCNTs、PLA/MWCNTs和Cu-β-CD/PLA/MWCNTs的SEM圖。MWCNTs呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)沒有聚集，這種結(jié)構(gòu)可以有效地提高比表面體積并促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移。L-Arg在MWCNTs表面電聚合后，MWCNTs被包埋在LPA基質(zhì)中并觀察到多孔簇狀納米復(fù)合膜，多孔簇狀結(jié)構(gòu)可能會擴(kuò)大修飾電極的界面并提供更多的識別位點以擴(kuò)大識別差異。Cu-β-CD自組裝后形成光滑的褶皺膜結(jié)構(gòu)，同時也表明Cu-β-CD已成功組裝到PLA/MWCNTs表面。

圖1 MWCNTs(A)、PLA/MWCNTs(B)和Cu-β -CD/PLA/MWCNTs(C)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of MWCNTs(A),PLA/MWCNTs(B) and Cu-β -CD/PLA/MWCNTs(C)

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)表征

采用循環(huán)伏安法(CV)研究了在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1 mol·L-1KCl)中不同電極界面的電化學(xué)行為(掃描速率為100 mV·s-1)。如圖2A所示，在裸GCE上觀察到一對對稱氧化還原峰，用MWCNTs修飾電極后，電流信號明顯增強(qiáng)，證明MWCNTs可以促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移效率。當(dāng)L-Arg 引入MWCNTs/GCE表面時，其電流信號略有提高。Cu-β-CD在PLA表面自組裝后，由于Cu-β-CD導(dǎo)電能力弱，使得峰電流減小。

進(jìn)一步通過電化學(xué)交流阻抗譜(EIS)對不同電極界面進(jìn)行研究。如圖2B所示，與裸GCE相比，MWCNTs/GCE的阻抗顯著降低，表明MWCNTs有良好的導(dǎo)電性并且能促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移。L-Arg聚合到表面后，半圓幾乎消失，然而Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE顯示出最大的阻抗(800 Ω)，這與CV法的結(jié)果一致。

圖2 不同電極在含0.1 mol·L-1 KCl的5.0×10-3 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環(huán)伏安圖(CVs)(A)和交流阻抗圖(EIS)(B)Fig.2 CVs(A) and EIS(B) of different electrodes in 5.0×10-3 mol·L-1 [Fe(CN)6]3-/4- solution containing 0.1 mol·L-1 KCl

2.3 修飾電極對色氨酸異構(gòu)體的識別

在0.1 mol·L-1PBS(pH = 8.0)中，通過示差脈沖伏安法(DPV)研究1.0×10-3mol·L-1L-Trp和D -Trp 在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的電化學(xué)行為(圖3)。在裸GCE上，Trp異構(gòu)體之間幾乎沒有峰值差異。當(dāng)引入MWCNTs時，Trp異構(gòu)體的峰電流明顯增強(qiáng)，然而電位差仍然很小，表明MWCNTs對Trp的氧化具有電催化作用。而PLA/MWCNTs/GCE對Trp的對映選擇性明顯提高，其峰電流比(IL/ID)為2.90，這可能歸因于L-Arg和Trp對映體之間的相互作用。當(dāng)Cu-β-CD引入時，識別效果進(jìn)一步提高，峰電流比為3.37，電位差為68 mV。通過Trp在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的識別效果，可知識別能力是P-L-Arg和Cu-β-CD的協(xié)同作用，增加了手性識別的差異，從而提高了識別效率。

圖3 1.0×10-3 mol·L-1的L-Trp(a)和D -Trp(b)的在不同電極上的示差脈沖伏安(DPV)響應(yīng)Fig.3 DPV responses of 1.0×10-3 mol·L-1 L-Trp(a) and D -Trp(b) at different electrodes(A) bare GCE;(B) MWCNTs/GCE;(C) PLA/MWCNTs/GCE;(D) Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE.

2.4 Trp對映異構(gòu)體的電化學(xué)檢測

為了進(jìn)一步研究不同濃度Trp對映異構(gòu)體在Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE上的電流響應(yīng)，采用DPV法對一系列濃度的Trp對映異構(gòu)體進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明隨著Trp濃度增大，電流響應(yīng)信號也隨之增大，并且與Trp濃度呈線性關(guān)系。在1.0×10-6～5.5×10-5mol·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，檢出限(S/N=3)可達(dá)3.3×10-7mol·L-1。二者的線性方程分別為：Ip(μA)=2.079+0.293cL-Trp(R2=0.9945)；Ip(μA)=2.143+0.104cD -Trp(R2=0.9932)。

圖4 不同濃度L-Trp(A)和D -Trp(B)對映異構(gòu)體在Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE上的DPV響應(yīng)(內(nèi)插圖為相應(yīng)校正曲線)Fig.4 DPV responses of different concentrations for L-trp(A) and D -Trp(B) at Cu-β -CD/PLA/MWCNTs/GCE(Inset shows the corresponding calibration plots)

2.5 Trp對映異構(gòu)體檢測比較

目前，采用電化學(xué)方法對Trp對映異構(gòu)體識別和檢測已取得了很大的進(jìn)展。在表1中，將本方法與現(xiàn)有的研究成果進(jìn)行比較，結(jié)果證明Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE對Trp對映異構(gòu)體展現(xiàn)出較高的手性識別、較低的檢測限和較寬的線性范圍。

表1 色氨酸對映異構(gòu)體識別方法對比

3 結(jié)論

本文將Cu-β-CD自組裝在PLA/MWCNTs納米復(fù)合膜上，然后修飾在玻碳電極表面，構(gòu)建了一個電化學(xué)手性傳感器Cu-β-CD/PLA/MWCNTs/GCE，并將其用于L-Trp和D -Trp的手性識別研究。由于L-Trp 和D -Trp的空間構(gòu)型的差異，導(dǎo)致異構(gòu)體與Cu-β-CD產(chǎn)生不同程度的包合作用，從而達(dá)到手性識別效果。實驗結(jié)果表明，該傳感器可以對Trp手性異構(gòu)體進(jìn)行有效地識別檢測，有望應(yīng)用于實際檢測中。