磁性氧化石墨烯固相萃取-超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定環(huán)境水體中微囊藻毒素

劉小燕， 李欣悅， 高仕謙，2， 蔣劉婧， 張占恩，2， 張麗君*，2

(1.蘇州科技大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇蘇州 215000; 2.蘇州科技大學環(huán)境與工程重點實驗室，江蘇蘇州 215000 3.南京大學環(huán)境學院，江蘇南京 210000)

隨著社會生活及工業(yè)化進程的迅速發(fā)展，大量含有氮、磷元素的污染物通過地表徑流和排污管網(wǎng)等方式進入環(huán)境水體，導致水體富營養(yǎng)化，使得某些藻類物質(zhì)會在水體中快速增長繁殖，產(chǎn)生水華，釋放微囊藻毒素(Microcystins,MCs)等有害物質(zhì)[1 - 2]，對人們健康構(gòu)成重大威脅。世界衛(wèi)生組織和我國飲用水衛(wèi)生規(guī)范皆規(guī)定，飲用水中的MCs濃度不得高于1.0 μg/L[3]。因此，建立水中MCs檢測方法具有極其重要的意義。

當前，環(huán)境水體中MCs的檢測多采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4 - 5]。而前處理方法主要有固相萃取[6 - 9]、固相微萃取[10]、磁性微萃取[11]、加速溶劑萃取[12]等。近年來，磁固相萃取(Magnetic Solid Phase Extraction,MSPE)[13]技術(shù)逐漸興起，該技術(shù)具有便捷操作簡單、分離，在復(fù)雜基質(zhì)體系中易于分離等優(yōu)點。氧化石墨烯(GO)具有較大比表面積[14 - 15]，對一些環(huán)境污染物具有高吸附性。本研究采用一步合成法合成磁性氧化石墨烯(MGO)，并將其用作磁固相萃取材料對環(huán)境水體中的MCs進行分離富集，結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC/MS)進行分析測定。該檢測方法靈敏度較優(yōu)，檢出限理想，為MCs的分析測定提供簡單快捷的測試方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

TSQ Quantum Ultra EMR三重四極桿質(zhì)譜儀、Ultimate 3000高效液相色譜儀、Quanta FEG 250掃描電子顯微鏡(美國，F(xiàn)EI公司)；Nicolet-6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國，Thermo公司)；VD115真空干燥箱(德國，Binder公司)；KQ-300VDE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q Academic超純水凈化器(美國，Millipore公司)；JJ-1精密增力電動攪拌器、SK-1快速混勻器(金壇市科析儀器有限公司)；HY-2調(diào)速多用振蕩器(蘇州威爾實驗用品有限公司)；DC-12型氮吹儀(上海安普公司)。

MC-LR、MC-RR標準品(純度≥98%，美國O2Si公司)，采用色譜純甲醇分別配制100.0 μg/mL的單標準儲備溶液，于-20 ℃儲存，使用時用甲醇稀釋為1.0 μg/mL的工作溶液。氧化石墨烯(GO)粉末的純度為99%，單層率≥96%(濟寧利特納米技術(shù)有限責任公司)；FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、丙酮、甲酸、冰乙酸、無水乙醇(分析純，國藥集團)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，阿拉丁生化科技股份有限公司)。實驗用水由Milli-Q純水凈化器(美國Millipore公司)制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 磁性納米材料的合成稱取1.0 g GO于200 mL超純水中，均勻攪拌后，超聲2 h。稱取2.716 g FeCl3·6H2O溶于200 mL超純水中，再加入1.675 g FeSO4·7H2O攪拌溶解。將溶液移至四頸燒瓶中，在室溫下勻速攪拌1 h，使其充分混合。再在高純氮氣保護下，80 ℃水浴、攪拌狀態(tài)下將GO懸浮液加入上述溶液中，逐滴加入10 mL氨水，反應(yīng)1 h，隨后將水浴溫度降至50 ℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h。最終得到深褐色沉淀物，用超純水和無水乙醇交替各洗滌3次后，過濾，濾渣于60 ℃真空干燥12 h，研磨后得到2.5403 g GO -Fe3O4，即MGO粉末。

1.2.2 樣品前處理準確稱取10.0 mg MGO至含有1.0 μg/L MC-LR和MC-RR的100 mL水樣中，調(diào)節(jié)溶液pH至4.0，振蕩吸附15 min，而后磁分離，傾去上清液，水分除盡，加入1.5 mL含0.1%甲酸甲醇，渦旋解吸1.5 min，經(jīng)0.22 μm有機濾膜濾于10 mL離心管中，如此重復(fù)解吸2次。氮氣揮干溶劑，采用1 mL初始流動相溶解后，進行UPLC/MS分析測試。

1.2.3 色譜/質(zhì)譜條件Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(50×3.0 mm，1.8 μm)；流動相：甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫程序如下：0～3.0 min，5%～95%A；3.0～4.5 min,95%～100%A；4.5～5.0 min，100%A；5.0～5.1 min，100%～5%A；5.1～8 min，5%A；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。電噴霧電離，正離子模式(ESI+)；選擇反應(yīng)模式(SRM)監(jiān)測；傳輸管溫度：350 ℃；噴霧溫度：300 ℃；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣壓力：35 MPa；輔助氣壓力：15 MPa；SRM模式的參數(shù)如表1所示。

表1 MC-LR和MC-RR的保留時間、母離子、子離子和碰撞能量

Notes:*Quantitativeion.

2 結(jié)果和討論

2.1 材料合成的過程分析

采用掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)和傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜表征材料的結(jié)構(gòu)形貌。圖1a是GO的SEM圖，圖1b是MGO的SEM圖，圖1c和1d是MGO的TEM圖。由圖可知GO的表面有大量褶皺，比表面積大，形成的Fe3O4大量附著在點位上，在外加磁場作用下，MGO可有效地與基質(zhì)分離。

圖1 GO(a)和MGO(b)掃描電鏡(TEM)及MGO(c，d)的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 SEM images of GO(a),MGO(b) and TEM images of MGO(c,d)

圖2為MGO的IR光譜譜圖，3 423 cm-1處是MGO的水分子的O-H吸收峰，1 577 cm-1處是羧基中C=O 的吸收峰，1 460 cm-1處的吸收峰是COO-的伸縮振動，1 324 cm-1處是C-O-C的吸收峰，622 cm-1處是Fe-O的吸收峰值，為Fe3O4的特征峰。

此外，還對MGO材料進行了比表面積(BET)、孔徑分布(BJH)和磁滯回線分析。結(jié)果表明，材料BET是115.9 m2/g，孔體積是 0.144 cm3/g，孔徑是8.375 nm。由圖3可知，磁性強度是49.2 emu/g。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)e3O4成功負載到石墨烯材料上。

圖2 MGO的紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectra of MGO

圖3 MGO的磁滯回線圖Fig.3 Magnetic hysteresis loop of MGO

2.2 磁固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 MGO用量的選擇在前處理過程中，吸附劑用量是一個重要考察因素。如圖4所示，當MGO由2.0 mg增大至10.0 mg時，萃取效率逐步提高，而吸附劑用量由10.0 mg 持續(xù)增大至12.0 mg 時，效率略有降低。因此將MGO的加入量定為10.0 mg。

2.2.2 水樣pH值及離子強度的影響溶液的pH可以對MGO與目標物表面電荷分布產(chǎn)生作用。實驗選取pH值范圍為2.0～12.0進行分析，結(jié)果如圖5。2種目標MCs在pH值為4.0時吸附效果最佳。這是由于MGO表面帶有大量的正電荷，在酸性條件下，MGO對目標物分子具有更理想的萃取效果，而隨著溶液pH值的升高，MGO表面正電荷的數(shù)目減少，靜電力的削弱致使其對目標物的吸附效率隨之減小。

圖4 MGO用量對萃取效率的影響Fig.4 Effect of MGO amount on extraction efficiency

圖5 pH值對萃取效率的影響Fig.5 Effect of pH on extraction efficiency

本實驗向水溶液中加入一定量的NaCl，以調(diào)節(jié)水樣的離子強度，選取水樣中NaCl濃度范圍為0%～25%。實驗結(jié)果表明，水樣中NaCl的濃度越高，吸附效率卻隨之減小，所以不需要調(diào)節(jié)水樣的離子強度。

2.2.3 吸附時間的優(yōu)化實驗選取萃取時間為0、5、10、15、20、25、30 min，結(jié)果表明當萃取時間延長至15 min時，萃取效率逐漸提高；當萃取時間由15 min增大至30 min時反而導致了萃取效率的降低。為了保證較好萃取效率，所以選取15 min 為后續(xù)實驗的吸附時間。

2.2.4 洗脫劑條件的優(yōu)化本實驗中考察了甲醇(含0.1%甲酸)、甲醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷對于目標物洗脫效率的影響。結(jié)果表明，丙酮、二氯甲烷和乙腈均不能有效地將目標物MC-LR和MC-RR從納米材料表面洗脫，而含0.1%甲酸甲醇洗脫效果較好。實驗分別采用2.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脫兩次，3.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脫三次，3.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脫兩次，5.0 mL的含0.1%甲酸甲醇洗脫兩次。結(jié)果表明，MC-RR的洗脫效率在2.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脫兩次，3.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脫三次，3.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脫兩次時逐步增大，5.0 mL含0.1%甲酸甲醇洗脫兩次時略有降低；MC-LR的洗脫效率在逐步增大。本實驗選擇3.0 mL洗脫兩次進行后續(xù)處理。

綜上結(jié)果，優(yōu)化萃取和洗脫條件為：磁性氧化石墨烯的稱取量10.0 mg，水樣pH為4.0，振蕩時間選取15 min，含0.1%甲酸甲醇為洗脫劑，用量為3.0 mL洗脫兩次，洗脫3 min。

2.3 方法的評估

配制MC-LR和MC-RR濃度為0.05～1.0 μg/L，體積為100 mL模擬試液，經(jīng)MGO萃取后經(jīng)由UPLC/MS檢測，MC-LR與MC-RR的濃度與色譜峰面積線性關(guān)系都較好。向超純水中加入MCs標液，使水樣中目標物濃度均為1.0 μg/L，分別于1 d內(nèi)及連續(xù)3 d分析測定，各測定5個平行樣，計算得到相對標準偏差(RSD)。結(jié)果如表2所示。

表2 MC-LR和MC-RR的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)和精密度

2.4 實際水樣的測定

采集太湖三個點位(漫山、漁洋山、太湖北)的實際環(huán)境水樣，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，加入MCs標準品，使其濃度分別為0.05 μg/L和0.50 μg/L，在本文優(yōu)化條件下測定，結(jié)果如表3。數(shù)據(jù)顯示，太湖北的水樣中檢測到少量的 MC-RR，漫山點位水樣的加標回收率均處于89.9%～102.7%范圍內(nèi)，RSD不超過7.5%；漁洋山點位水樣2種MCs的回收率為84.3%～109.1%，RSD不超過7.8%；太湖北點位水樣的回收率處于89.6%～108.6%，RSD不超過 9.3%?？梢钥闯?，本方法的重現(xiàn)性良好，精密度較高，可以應(yīng)用于實際水樣中MCs的測定。

表3 太湖水樣中MCs的回收率和相對標準偏差(n=5)

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3 結(jié)論

本研究探究以磁性氧化石墨烯作為萃取材料，分離富集水樣中MC-LR和MC-RR。水中目標污染物在痕量級別(1.0 μg/L[3])可以用這種方法進行分離分析。這一方法操作時間短、重現(xiàn)性好、檢測限低、目標物質(zhì)的萃取效率高，適用于檢測水體中的痕量微囊藻毒素。