乳酸菌、酵母菌的篩選鑒定及其在米發(fā)糕中的應(yīng)用

李美倫 - 姜萌藝 - 龔川杰 - 何 利

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

米發(fā)糕的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式是在新鮮米漿中接入老漿進(jìn)行發(fā)酵[1-2]，發(fā)酵過程中微生物體系的菌種比例和活性難以控制，會(huì)導(dǎo)致其生產(chǎn)周期延長且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[3][4]9。

在淀粉食物原料的發(fā)酵過程中，優(yōu)勢(shì)菌主要為酵母菌和乳酸菌，兩者可進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵并對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味和營養(yǎng)成分的形成起著重要作用[1,3,5-6]。目前，對(duì)米發(fā)糕發(fā)酵劑的研究多為雙菌發(fā)酵劑[7-8][9]32-42，該種發(fā)酵劑與老漿發(fā)酵相比仍有一定差距，因而米發(fā)糕發(fā)酵劑的菌種組成還有待進(jìn)一步優(yōu)化。發(fā)酵制品中的微生物組成與地理位置有很大聯(lián)系[10]，目前尚未見有關(guān)中國四川地區(qū)米發(fā)糕的研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬以四川雅安地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵米漿為研究對(duì)象，對(duì)其中具有良好發(fā)酵性能的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行篩選，并用作米發(fā)糕的復(fù)合發(fā)酵劑，以期為米發(fā)糕的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵米漿：采自四川省雅安市雨城區(qū)消費(fèi)者評(píng)價(jià)較好的米發(fā)糕作坊，共5份；

早秈米、白砂糖：均購于四川省雅安市吉選超市；

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH (6.2±0.2)，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，碳酸鈣15 g，121 ℃滅菌20 min；

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸出粉130 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH (6.0±0.2)，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，121 ℃滅菌20 min[11]；

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麥芽浸粉：生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

PCR反應(yīng)試劑、DNA Marker：生工生物工程 (上海) 股份有限公司；

其他試劑：分析純，雅安市萬科化學(xué)試劑公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

PCR儀：C1000型，美國Bio-Rad公司；

冷凍離心機(jī)：D-37520型，美國Thermo公司；

物性分析儀：TA-XT plus型，英國Stable Micro systems公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

(1) 分離：取米漿樣品進(jìn)行梯度稀釋并分別涂布于MRS培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基于37 ℃(麥芽汁培養(yǎng)基于28 ℃)培養(yǎng)48 h。分別挑取具有溶鈣圈及不同菌落特征的疑似乳酸菌菌落和具有不同菌落特征的疑似酵母菌菌落進(jìn)行劃線純化。

(2) 篩選：對(duì)疑似乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色和菌株形態(tài)觀察，選擇具有典型乳酸菌特征的菌株進(jìn)行斜面保藏和甘油管冷凍保藏(菌液和60%甘油按1∶1的體積比接入甘油管內(nèi)并置于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱內(nèi))。對(duì)疑似酵母菌進(jìn)行水浸片鏡檢，選擇具有典型酵母菌特征和良好產(chǎn)氣性能的菌株進(jìn)行斜面保藏和甘油管冷凍保藏(與乳酸菌菌種保藏方法一致)。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將篩得的乳酸菌劃線至MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，酵母菌劃線至麥芽汁培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng)24～48 h。乳酸菌16S rDNA鑒定選用細(xì)菌通用引物27F和1492R[12]，酵母菌26S rDNA鑒定選用真菌通用引物NL1和NL4[13]，均以挑取單菌落至7 μL無菌水中得到的菌液為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇相似度較高的序列，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株生長性能測(cè)定 將活化后的乳酸菌菌液按2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基(酵母菌菌液按同樣接種量接入麥芽汁培養(yǎng)基)，在0～24 h時(shí)，每隔2 h測(cè)定菌液在600 nm處的OD值，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.4 液體復(fù)合發(fā)酵劑的制備 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期的菌液(乳酸菌濃度為108CFU/mL，酵母菌濃度為107～108CFU/mL)，離心(4 000 r/min，30 min)，用0.9%的生理鹽水使菌體復(fù)懸，備用[9]22-23。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定出植物乳桿菌分別與釀酒酵母菌、矮小假絲酵母菌的復(fù)配體積比為1∶9時(shí)，發(fā)酵得到的米發(fā)糕具有良好的感官和質(zhì)構(gòu)特性。因此在已經(jīng)確定植物乳桿菌與酵母菌比例的基礎(chǔ)上，確定植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母菌懸液體積比為1.0∶1.8∶7.2，1.0∶3.0∶6.0，1.0∶4.5∶4.5，1.0∶6.0∶3.0，1.0∶7.2∶1.8(依次對(duì)應(yīng)1～5號(hào))的比例進(jìn)行復(fù)配，制備液體復(fù)合發(fā)酵劑。

1.2.5 米發(fā)糕的制作 根據(jù)文獻(xiàn)[4]36修改如下：早秈米在30 ℃下浸泡21 h，瀝水后磨成米粉并過60目篩，將所得米粉與水按8∶2的質(zhì)量比混勻得到米漿。以米漿量為基準(zhǔn)，接入體積分?jǐn)?shù)為5%的復(fù)合發(fā)酵劑和6 g/100 mL的白砂糖后攪勻，于35 ℃發(fā)酵12 h，發(fā)酵結(jié)束后，再加入14 g/100 mL 的白砂糖進(jìn)行調(diào)味，得到發(fā)酵米漿。將米漿定量盛入模具內(nèi)，沸水蒸20 min，得到米發(fā)糕。

1.2.6 感官評(píng)定 感官評(píng)定小組由10人組成。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]21制訂，見表1。

1.2.7 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定 采用P/36 R探頭對(duì)樣品進(jìn)行TPA測(cè)定，參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.8 米發(fā)糕風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 色譜條件根據(jù)文獻(xiàn)[9]43-44進(jìn)行設(shè)定，定量定性分析：將GC-MS圖譜用NIST.11譜庫進(jìn)行檢索，僅報(bào)告匹配度>80%的鑒定結(jié)果并采用面積歸一化法計(jì)算樣品中各組分的相對(duì)含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2010繪制圖表，用 SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)，P<0.05判定為顯著性變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

2.1.1 菌落及菌株形態(tài)特征 對(duì)米漿樣品中的疑似乳酸菌進(jìn)行分離純化獲得12株具有溶鈣圈的純菌株，其中2株為革蘭氏陽性菌且具有典型的乳酸菌菌落及菌株形態(tài)特征，將其分別編號(hào)為R-1a、R-2b。對(duì)米漿樣品中的疑似酵母菌進(jìn)行分離純化獲得7株純菌株，其中5株具有酵母菌典型的菌落、菌株形態(tài)特征且在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其均具有良好的產(chǎn)氣性能，將其分別編號(hào)為J-1a、J-2a、J-3a、J-4a、J-5a。菌落及菌株形態(tài)特征見表2。

表1 感官評(píng)價(jià)表

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)Blast相似性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，R-1a和R-2b與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性均為99%，故將其鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，但R-1a和R-2b的基因序列有所不同；J-1a、J-4a和J-5a與矮小假絲酵母菌(Candidahumili)的同源性均為99%且基因序列相同，故將其鑒定為矮小假絲酵母菌(Candidahumili)；J-2a和J-3a與釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的同源性均達(dá)100%且基因序列相同，故將其鑒定為釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。根據(jù)菌落、菌株形態(tài)特征及鑒定結(jié)果，選擇R-1a、R-2b和J-1a、J-2a進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株生長特性

菌株24 h內(nèi)的生長曲線見圖2。R-1a和R-2b在24 h內(nèi)生長速率相當(dāng)，將其分別與篩得的酵母菌復(fù)配進(jìn)行發(fā)酵預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵得到的米發(fā)糕的感官品質(zhì)差異不明顯，因此選用其中1株乳酸菌作為米發(fā)糕發(fā)酵劑復(fù)配菌株之一。在0～10 h時(shí)J-2a生長速率明顯快于J-1a，2株酵母菌大致在10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，其中J-2a在穩(wěn)定期內(nèi)的OD 值高于J-1a。雖然矮小假絲酵母常存在于發(fā)酵食品中且被認(rèn)為是酸面團(tuán)中較為常見的一種酵母菌[15]，但在中國諸多發(fā)酵米漿中微生物菌系的研究中未見報(bào)道。有研究[16]表明矮小假絲酵母和釀酒酵母均具有較快的產(chǎn)氣速率，但兩者單獨(dú)發(fā)酵所得饅頭的主要揮發(fā)性成分種類不同。因此選擇R-2b(植物乳桿菌Lactobacillusplantarum)、J-1a(矮小假絲酵母Candidahumilis)及J-2a(釀酒酵母Saccharom-ycescerevisiae)復(fù)配制作米發(fā)糕三菌復(fù)合發(fā)酵劑。

表2 乳酸菌、酵母菌菌落及菌株形態(tài)特征

2.3 復(fù)配菌比對(duì)米發(fā)糕感官品質(zhì)的影響

5組不同復(fù)配菌比所得米發(fā)糕的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見圖3、 4。在形態(tài)方面，2號(hào)米發(fā)糕內(nèi)部孔洞細(xì)密均勻，其他4組米發(fā)糕內(nèi)部孔洞大小及分布不均且都不如2號(hào)米發(fā)糕蓬松；在香氣和滋味方面，2號(hào)米發(fā)糕相較于其他4組米發(fā)糕，具有柔和的發(fā)酵風(fēng)味和醇香且酸甜適中；在口感和色澤方面，5組米發(fā)糕差異不明顯。可能是不同復(fù)配菌比會(huì)影響酵母菌的產(chǎn)氣能力，使得米發(fā)糕的內(nèi)部組織產(chǎn)生差異，同時(shí)不同復(fù)配菌比會(huì)影響到微生物產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物對(duì)大米淀粉、蛋白質(zhì)等成分的作用，導(dǎo)致米發(fā)糕在氣味、滋味方面有較大變化[17]。綜合感官評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)可得到2號(hào)復(fù)配體積比R-2b∶J-2a∶J-1a=1∶3∶6得到的米發(fā)糕的感官得分最高。

圖2 乳酸菌、酵母菌生長曲線

圖3 三菌復(fù)配米發(fā)糕感官評(píng)價(jià)單項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分

Figure 3 The singer index score of the rice steamed sponge cake by three strains compounded

2.4 復(fù)配菌比對(duì)米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)特性的影響

根據(jù)表3可知，5組不同復(fù)配菌比發(fā)酵得到的米發(fā)糕在回復(fù)性上無顯著性差異(P>0.05)，在彈性和內(nèi)聚性上僅3號(hào)和5號(hào)有顯著性差異(P<0.05)，因此選擇硬度、膠著性和咀嚼性評(píng)價(jià)米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性與米發(fā)糕的品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[18]。隨著釀酒酵母占比的增加，米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性先減小后增大，當(dāng)植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母的體積比為1∶3∶6時(shí)，米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性均最小，說明該復(fù)配菌比有利于菌株間協(xié)同發(fā)酵作用，可以改善米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

1～5對(duì)應(yīng)復(fù)配菌比組號(hào)1～5號(hào)

2.5 發(fā)酵劑對(duì)米發(fā)糕揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

采用HS-SPME-GC-MS法分析4種米發(fā)糕的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(樣品1：發(fā)酵劑為植物乳桿菌與矮小假絲酵母按1∶9的體積比復(fù)配；樣品2：發(fā)酵劑為植物乳桿菌與釀酒酵母按1∶9的體積比復(fù)配；樣品3：發(fā)酵劑為植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母按1∶3∶6的體積比復(fù)配；樣品4：市售老漿發(fā)酵米發(fā)糕)。

由表4、5可知，4種米發(fā)糕中共同檢出的風(fēng)味物質(zhì)有5種，包括苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、十四烷和棕櫚酸乙酯。4種樣品中相對(duì)含量最多的均為醇類，主要是苯乙醇，這與吳鵬[9]49研究的結(jié)果一致，苯乙醇具有新鮮面包香及玫瑰香，是米發(fā)糕、饅頭的重要呈香物質(zhì)[19-20]。

表3 不同菌比米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果?

? 同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。

樣品1、2、3及4中分別檢出16，17，29，13種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，不同樣品中的風(fēng)味物質(zhì)有所差異，主要表現(xiàn)在酸類、醇類、醛類、酯類等物質(zhì)上。樣品1中酸類和醛類的相對(duì)含量明顯高于樣品2中的，但其醇類物質(zhì)的相對(duì)含量明顯低于樣品2的，其中乙酸、苯乙醛以及樣品2中特有的2,3-丁二醇是造成差異的主要原因，可能是發(fā)酵所用的酵母菌不同引起的。盡管樣品1、2中醇類和酸類的相對(duì)含量都較高，但酯類物質(zhì)的含量均較低，由此可知醇類與酸類物質(zhì)的含量并不與酯類物質(zhì)的含量呈正比[21]。與樣品1、2相比，樣品3中酸類和醇類物質(zhì)的相對(duì)含量明顯減少，但酯類物質(zhì)相對(duì)含量和種類顯著增加，可能是矮小假絲酵母菌和釀酒酵母菌之間存在協(xié)同作用促進(jìn)了酯類物質(zhì)的生成。酯類物質(zhì)的閾值較低是影響食品風(fēng)味的重要成分[22]，樣品1、2和3中共同檢出了4種酯類物質(zhì)，包括乙酸苯乙酯(玫瑰香和果香[22])、癸酸乙酯(葡萄香氣)、辛酸乙酯和棕櫚酸乙酯(花果香、奶香[23])。此外，樣品3中還檢出9種特有的酯類物質(zhì)，包括棕櫚酸甲酯(微弱的蠟香、果香和奶油香[23])、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞油酸乙酯(均具有油脂香氣[23])以及α-戊基-γ-丁內(nèi)酯(果香)等。這些酯類物質(zhì)可賦予米發(fā)糕果香和奶香。

與樣品3相比，市售米發(fā)糕中醛類和呋喃類物質(zhì)的相對(duì)含量更多，但酸類和酯類物質(zhì)的種類和相對(duì)含量明顯減少，可能是2種樣品發(fā)酵時(shí)微生物體系有較大差異(如菌種組成及菌比的不同)造成的。此外，對(duì)樣品3、4進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表6。樣品3的感官得分高于樣品4，同時(shí)受試人員反映三菌復(fù)合發(fā)酵得到的米發(fā)糕酸甜適宜并有回味，香氣適宜且具有柔和的發(fā)酵味和醇香味，而市售米發(fā)糕的滋味略偏酸，香氣較淡。結(jié)合GC-MS測(cè)定結(jié)果可知，與其他3種米發(fā)糕相比，三菌復(fù)合發(fā)酵劑得到的米發(fā)糕所含的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類更為豐富，但這些風(fēng)味物質(zhì)與產(chǎn)品香氣、滋味的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

圖5 4種米發(fā)糕GC-MS總離子流圖

表4 米發(fā)糕揮發(fā)性風(fēng)味成分及含量?

? “—”為未檢出。

表5 不同米發(fā)糕樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)類別統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表6 與市售樣品的感官品質(zhì)對(duì)比

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從四川雅安地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵米漿中篩選得到3株能夠復(fù)配用于米發(fā)糕發(fā)酵的菌株，經(jīng)測(cè)序分析確定分別為植物乳桿菌、釀酒酵母菌和矮小假絲酵母菌。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)三菌復(fù)配體積比為R2-b∶J-2a∶J-1a=1∶3∶6時(shí)，發(fā)酵得到的米發(fā)糕具有最優(yōu)的感官品質(zhì)和質(zhì)構(gòu)特性，并由GC-MS檢測(cè)到29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與雙菌復(fù)合發(fā)酵劑和老漿發(fā)酵的米發(fā)糕相比，該種米發(fā)糕所含的風(fēng)味物質(zhì)更為豐富，尤其是酯類物質(zhì)，同時(shí)與市售米發(fā)糕相比，其還具有更優(yōu)的感官品質(zhì)?；谝陨涎芯?，植物乳桿菌、釀酒酵母菌及矮小假絲酵母菌作為復(fù)合發(fā)酵劑可用于米發(fā)糕的生產(chǎn)。

本試驗(yàn)還對(duì)比分析了2種酵母菌對(duì)米發(fā)糕風(fēng)味的影響，補(bǔ)充了矮小假絲酵母菌在米發(fā)糕中應(yīng)用的研究。但植物乳桿菌、釀酒酵母菌及矮小假絲酵母菌對(duì)米發(fā)糕風(fēng)味物質(zhì)影響的機(jī)理，還有待進(jìn)一步研究。