吳茱萸次堿對(duì)高糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知障礙的影響*

陳建國(guó)，吳亞更，李 響

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，錦州 121001)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病。AD的兩大主要神經(jīng)病理學(xué)特征是形成大量過(guò)度磷酸化tau 蛋白為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和β-淀粉樣多肽為主要成分的老年斑[1,2]。正常的 tau 蛋白可使神經(jīng)元骨架蛋白保持穩(wěn)定，但過(guò)度磷酸化的tau蛋白可破壞細(xì)胞骨架，影響神經(jīng)元胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致突觸功能紊亂和神經(jīng)元退化[3]。微管相關(guān)蛋白tau病變是AD早期病變，其磷酸化水平與患者的癡呆程度成正相關(guān)。有研究顯示，高糖能導(dǎo)致應(yīng)激觸發(fā)的急性嚴(yán)重認(rèn)知損害，表現(xiàn)為一種海馬可逆性tau蛋白過(guò)度磷酸化改變[4]。糖代謝紊亂會(huì)加劇AD模型鼠tau蛋白磷酸化和空間學(xué)習(xí)記憶障礙。因此研究針對(duì)tau蛋白過(guò)度磷酸化為靶點(diǎn)的藥物可能對(duì)AD的治療具有重要意義。

吳茱萸次堿(Rutaecarpine，Rut)是從吳茱萸將近成熟的果實(shí)中提取出來(lái)的一種吲哚喹啉類生物堿，對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，在TRPV1敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)海馬依賴性學(xué)習(xí)、記憶缺陷和突觸可塑性受損[5]。Rut作為辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)高選擇性激動(dòng)劑[6]，除了作為強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥和抗炎藥的作用外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可以提高腦缺血/再灌注損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[7]，但在體內(nèi)Rut是否對(duì)高糖誘導(dǎo)的AD大鼠空間記憶損傷具有保護(hù)作用，以及其如何發(fā)揮這種保護(hù)作用尚未可知。本研究旨在探討Rut對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠 AD 樣病理變化和認(rèn)知功能障礙的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 抗體與試劑

吳茱萸次堿(純度98%)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、過(guò)硫酸銨、二喹啉甲酸蛋白測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和RIPA裂解液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，抗體PT205、PS214和R134d購(gòu)自abcam公司，抗體pS9-GSK-3β、GSK-3β和pY307-PP2AC/PP2A均購(gòu)自CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量分?jǐn)?shù)(250±20)g，SD大鼠許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。大鼠飼養(yǎng)溫度為25℃，正常晝夜節(jié)律。將大鼠隨機(jī)分成3組(n=20)。對(duì)照組、高糖組和吳茱萸次堿組。其中對(duì)照組大鼠給予常規(guī)飼料和自來(lái)水飼養(yǎng)，高糖組大鼠行常規(guī)飼料和20%蔗糖水飼養(yǎng)，吳茱萸次堿組行 0.01%吳茱萸次堿飼料和20%蔗糖水飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)24周后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，Morris水迷宮測(cè)試后2 h處死各組大鼠，取雙側(cè)新鮮海馬，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠海馬tau蛋白Thr205和Ser214位點(diǎn)以及S9-GSK-3β和pY307-PP2AC的蛋白表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬tau蛋白在Thr205位點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

水迷宮包括一圓形水池(高 60 cm，直徑 120 cm)和一個(gè)位置可改變的圓柱形有機(jī)玻璃平臺(tái)(直徑10 cm，高 40 cm)，平臺(tái)的頂端平面低于水池液面約 2 cm，實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫均維持在 25℃左右。大鼠在訓(xùn)練前 1 h移入水迷宮室，訓(xùn)練時(shí)將大鼠從第 III 象限 1/2 弧度處頭面向池壁輕放于水中，其游泳路徑經(jīng)水面上方 1.5 cm 處的攝像機(jī)拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)進(jìn)行采集，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，可提供潛伏期(即大鼠從入水點(diǎn)至找到平臺(tái)所用的時(shí)間)、穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。大鼠接受連續(xù)6 d的Morris水迷宮訓(xùn)練，每天4次。第6日記錄大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠tau蛋白Thr205和Ser214位點(diǎn)以及S9-GSK-3β和pY307-PP2AC的蛋白表達(dá)水平

Morris水迷宮測(cè)試后2 h處死各組大鼠取材。取雙側(cè)新鮮海馬，稱重剪碎，加入RIPA組織裂解液。在 4℃靜置 30 min，再加入1 mmol/L的 PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(1∶200)在4℃下超聲處理10 s，然后與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，在水浴中煮沸10 min。使用BCA法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度備用。將處理后的蛋白樣本通過(guò)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5% 脫脂奶粉封閉 2 h，分別孵育一抗PT205、PS214、S9-GSK-3β和pY307-PP2AC，置于4℃過(guò)夜。然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫溫育1 h，并用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒顯色。然后使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)顯影，最后使用ImageJ軟件對(duì)蛋白免疫印跡條帶進(jìn)行掃描和分析。

1.5 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)與海馬tau蛋白在Thr205位點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平

Morris水迷宮測(cè)試后，采用水合氯醛(50 mg/kg)腹腔注射深麻醉大鼠。采用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注固定大腦組織(去除小腦)，取出腦組織后再于上述固定液中后固定12 h，即可振蕩切片，切片厚度為 20 μm。挑選各組部位相同的腦片置于3% H2O2甲醇溶液處理切片30 min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，0.01 mmol/L的PBS 漂洗3個(gè)5 min；然后采用含 0.1%Triton 的緩沖液孵育20 min，增加細(xì)胞膜對(duì)抗體的通透性，0.01 mmol/L的PBS 漂洗3個(gè)5 min，加3% BSA室溫下封閉1 h。加入稀釋的一抗PT205(1∶250)、pS214(1∶500)，4℃ 孵育 24 h，0.01 mmol/L的PBS 漂洗3個(gè)5 min，加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗置于37℃孵育2 h，0.01 mmol/L的PBS 漂洗3個(gè)5 min，0.06%的DAB避光顯色5 min，0.01 mmol/L PBS充分沖洗以終止顯色反應(yīng)，將腦片貼于載玻片上晾干，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，最后置于顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Rut對(duì)高糖誘導(dǎo)的AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與對(duì)照組相比，高糖組大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)(表1)，尤穿越平臺(tái)的次數(shù)減少和在目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短(表2)。與高糖組相比，吳茱萸次堿大鼠尋找隱匿平臺(tái)的潛伏期的顯著縮短，尤其是第4～7日最為明顯(表1)，穿越平臺(tái)的次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著增加(表2)。

Tab. 1 The latency of time to find platform of the three groups(s， n=20)

CON:Control group;SUC:Sucrose group;RUT:Rutaecarpine group
*P<0.01vscontrol group;#P<0.01vsSUC group

Tab. 2 The number of crossing times to the platform and the time in target quadrant of each n=20)

*P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsSUC group

2.2 Rut對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響

與對(duì)照組相比，高糖組Thr205(pT205)，Ser214(pS214)位點(diǎn)的tau蛋白磷酸化水平增加，Rut組經(jīng)過(guò)tau5(總tau蛋白)標(biāo)準(zhǔn)化后，Thr205和Ser214位點(diǎn)tau蛋白過(guò)度磷酸化水平有所降低(圖1，表3)。免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示高糖組海馬(圖2)和皮質(zhì)(圖3)的Thr205位點(diǎn)tau蛋白磷酸化水平增強(qiáng)，與高糖組相比，Rut組tau蛋白Thr205位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化水平顯著降低(圖2，3)。

Fig.1Phosphorylation levels of tau protein at Thr205 and Ser214 sites of the three groups detected by Western blot

Tab. 3 Phosphorylation levels of tau protein at Thr205 and Ser214 sites were quantitatively n=8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsSUC group

2.3 Rut對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠海馬S9-GSK-3β和Y307-PP2A位點(diǎn)的磷酸化水平的影響

與對(duì)照組相比，高糖組大鼠Y307-PP2A位點(diǎn)的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化，S9-GSK-3β位點(diǎn)的磷酸化水平降低。與高糖組相比，吳茱萸次堿組Y307-PP2A位點(diǎn)的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化，S9-GSK-3β位點(diǎn)的磷酸化水平顯著增高(圖4，圖5，表4)。

Fig.4The levels of total GSK-3β and Ser9-phosphorylated GSK-3(S9-GSK-3β)were probed by Western blot

Fig.5The levels of total PP2A and Tyr307-phosphorylated PP2A(Y307-PP2A)were probed by Western blot

Tab. 4 The expressions of total GSK-3β,PP2A and S9-GSK-3β,Y307-PP2A were quantitatively analyzed n=6)

*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsSUC group

3 討論

神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成是AD特征性病理?yè)p害，其主要成分為過(guò)度磷酸化的tau蛋白。神經(jīng)原纖維纏結(jié)與AD患者的記憶損害程度正相關(guān)，并且被認(rèn)為是 AD 的早期病理改變[8]。因此，調(diào)控tau蛋白的過(guò)度磷酸化對(duì)減緩AD的發(fā)生和發(fā)展非常關(guān)鍵。

糖代謝紊亂或2型糖尿病與AD有相似的發(fā)病譜和危險(xiǎn)因素，而且二者有相似的臨床表現(xiàn)和行為學(xué)特征，認(rèn)為2型糖尿病是AD的危險(xiǎn)因素之一[9]。為檢測(cè)糖代謝紊亂模型大鼠是否出現(xiàn)AD樣的學(xué)習(xí)記憶障礙，本研究采用水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的差異。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖飲食24周大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，同時(shí)給予Rut可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降。

TRPV1是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)廣泛分布的非選擇性陽(yáng)離子通道，激活可產(chǎn)生以Ca2+內(nèi)流為主的陽(yáng)離子內(nèi)流。Rut是的TRPV1天然激活劑，Rut激活TRPV1除了具有抗中樞性神經(jīng)痛和和抗炎作用[10,11]外，對(duì)腦血管也具有保護(hù)作用，有研究報(bào)道Rut可以透過(guò)血腦屏障發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[12]，據(jù)報(bào)道，TRPV1的激活劑在多種腦缺血模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用[13]。但Rut是否對(duì)AD樣神經(jīng)病變具有保護(hù)作用以及激活TRPV1后通過(guò)什么途徑或方式保護(hù)神經(jīng)元、改善AD樣病變機(jī)制尚不清楚。為檢測(cè)高糖對(duì)大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響及Rut對(duì)此有無(wú)拮抗作用，本研究檢測(cè)了上述各組大鼠皮質(zhì)和海馬tau蛋白常見(jiàn)磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示，高糖飲食可以使tau蛋白在Thr205和Ser214位點(diǎn)的磷酸化水平顯著升高，同時(shí)給予Rut可減輕高糖所致的上述改變。結(jié)果提示，Rut可通過(guò)減輕tau蛋白的異常磷酸化程度而減輕高糖所致AD樣病理變化。

Tau蛋白的磷酸化主要受蛋白激酶和磷酸酯酶活性所調(diào)控。大量研究表明蛋白激酶和蛋白磷酸酶的不平衡是造成tau蛋白過(guò)度磷酸化的原因[14,15]。糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)激活和蛋白磷酸酯酶-2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的失活在AD患者tau蛋白過(guò)度磷酸化中起關(guān)鍵作用[16,17]。其中，其中GSK-3β的活性受絲氨酸9位點(diǎn)磷酸化水平影響，絲氨酸9位點(diǎn)磷酸化水平增加會(huì)導(dǎo)致GSK-3β激活，進(jìn)而可誘導(dǎo)tau蛋白多個(gè)相關(guān)位點(diǎn)的高度磷酸化，那么高糖誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化GSK-3β是否參與其中呢？于是本研究檢測(cè)了大鼠海馬中GSK-3β活性以及S9-GSK-3β的磷酸化水平。結(jié)果顯示，高糖組大鼠海馬組織中總的GSK-3β變化不明顯，但S9-GSK-3β的磷酸化水平變化顯著降低，而同時(shí)給予Rut處理能增強(qiáng)S9-GSK-3β位點(diǎn)的磷酸化水平。另外Y307-PP2A磷酸化水平增加會(huì)導(dǎo)致PP2A失活，進(jìn)而可誘導(dǎo)tau蛋白多個(gè)相關(guān)位點(diǎn)的高度磷酸化。因此，本研究還檢測(cè)了各組大鼠海馬PP2A活性和Y307-PP2A的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬組織中總的PP2A及Y307-PP2A的表達(dá)變化均不明顯。這些均提示，高糖誘導(dǎo)的tau蛋白AD樣過(guò)度磷酸化，可能主要通過(guò)激活GSK-3β，而不是通過(guò)失活磷酸酯酶PP2A。

本研究觀察到高糖24周可導(dǎo)致大鼠海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化，引起大鼠空間學(xué)習(xí)記憶受損，Rut通過(guò)增強(qiáng)海馬S9-GSK-3β位點(diǎn)的磷酸化水平來(lái)改善高糖誘導(dǎo)的大鼠AD樣病理改變和認(rèn)知功能障礙，本研究結(jié)果提示Rut可作為AD治療干預(yù)的潛在藥物靶標(biāo)。