DIO基因多態(tài)性與有氧耐力的相關(guān)性研究*

周文婷，胡 揚(yáng)

(1.遵義師范學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.北京體育大學(xué)，北京100084)

甲狀腺激素(thyroxine,TH)由甲狀腺分泌，主要有T4和T3兩種。此外，甲狀腺也可分泌極少量無活性的逆-T3(rT3)。TH功能廣泛，可影響個(gè)體的生長、發(fā)育、組織分化，調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝[1]，維持正常的心血管功能[2]和肌肉系統(tǒng)活性[3]，調(diào)節(jié)多種骨骼肌功能相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[4]并對(duì)個(gè)體的運(yùn)動(dòng)耐受性起維持作用[5]，其水平及活性的高低與個(gè)體的有氧耐力水平息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TH特別是T4的產(chǎn)生由下丘腦-垂體-甲狀腺軸控制；TH的功能，尤其是T3功能則主要由組織內(nèi)的碘代甲狀腺氨酸脫碘酶(iodothyronine deiodinase,DIO)與TH轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控[6]。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可直接或間接影響甲狀腺功能，此外，還可引起下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的急劇改變，或?qū)е逻\(yùn)動(dòng)員甲狀腺功能的長期改變，而運(yùn)動(dòng)員甲狀腺功能的改變被認(rèn)為是一種耐受能力的適應(yīng)性機(jī)制，該機(jī)制可使能量的攝取和消耗趨于平衡[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，幾個(gè)TH路徑基因的基因多態(tài)性可改變TH的活性。其中，一些多態(tài)位點(diǎn)不僅與常人血清中的TH水平有關(guān)，也與某些TH相關(guān)疾病有關(guān)，其中DIO1和DIO2基因研究較多[8-10]。DIO1表達(dá)于肝臟、腎臟和甲狀腺，可激活T4成為有活性的T3，與清除代謝物rT3的過程亦相關(guān)[8]。DIO2表達(dá)于腦、垂體、甲狀腺、骨骼肌、動(dòng)脈平滑肌和心臟等，在某些組織如大腦中，DIO2作用于T3在組織局部的產(chǎn)生，在骨骼肌中，DIO2則是血漿內(nèi)T3的主要來源[6]。一般認(rèn)為，T3/rT3比率是TH外周代謝的敏感指標(biāo)，其水平不受T4產(chǎn)生和血清中結(jié)合蛋白變化的影響，DIO1和DIO2對(duì)其發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用[9]。目前，尚沒有對(duì)DIO基因多態(tài)性與運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的報(bào)道。但DIO1基因的C785T位點(diǎn)及DIO2基因的Thr92Ala和Gly3Asp位點(diǎn)因可能影響血清TH水平而被廣泛研究[8-10]。因此本研究選擇這3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)為研究對(duì)象，通過對(duì)比優(yōu)秀耐力運(yùn)動(dòng)員(elite endurance athlete,EEA)與普通對(duì)照人群(control group,CG)中上述基因多態(tài)的分布特征，探討其作為影響有氧耐力素質(zhì)的分子遺傳學(xué)標(biāo)記的可能性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

中國北方漢族優(yōu)秀長跑運(yùn)動(dòng)員123人，其中男性62人，女性61人。運(yùn)動(dòng)專項(xiàng)分別為5/10 km或馬拉松組(92vs31)，運(yùn)動(dòng)等級(jí)為健將或國際健將組(80vs43)，其中5/10 km和馬拉松組各包括男、女運(yùn)動(dòng)員47人、45人和15人、16人，健將及國際健將組各包括男、女運(yùn)動(dòng)員51人、29人和11人、32人。中國北方漢族普通大學(xué)生(control group,CG)127人，其中男性56人，女性71人，均未經(jīng)任何專業(yè)訓(xùn)練，且其父母均無專業(yè)運(yùn)動(dòng)員背景，正常參加體育活動(dòng)，體檢合格。所有受試者均為漢族，其雙親、祖輩雙親也均為漢族，籍貫均為我國東北三省、華北五省、河南、山東及安徽北部，均知情同意，基本情況見表1。

Tab. 1 Characteristics of the elite endurance athletes and the control group

1.2 靜脈取血

常規(guī)方法取外周靜脈血并用基因組DNA純化試劑盒(Promega)從全血中提取基因組 DNA。

1.3 多態(tài)位點(diǎn)檢測

根據(jù)文獻(xiàn)研究報(bào)道[8-10]和SNP數(shù)據(jù)庫資料，通過HapMap和Haploview軟件分析，選取3個(gè)SNP位點(diǎn)：DIO1基因的C785T位點(diǎn)、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)。

SNP分型由Sequenom公司的Mass ARRAY系統(tǒng)完成。用基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF)，引物延伸的方法進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)解析，分析委托公司完成(上海邃志)。

PCR引物和單堿基延伸引物均由Assay Designer(Sequenom)軟件包設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增目的片段，針對(duì)SNP的單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。將終止反應(yīng)物脫鹽后點(diǎn)樣到spectro CHIP上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析。最終結(jié)果由 Mass ARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號(hào) 3.0.0.4)實(shí)時(shí)讀取，并由Mass ARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號(hào) 3.4)完成基因分型分析。

PCR反應(yīng)體系為：DNA樣本1 μl(5 ng/μl)；PCR引物1 μl；dNTP 1 μl(2.5 mmol/L)；MgCl20.325 μl(25 mmol/L)；HotStar Taq酶 0.1 μl；PCR緩沖液0.625 μl；H2O 0.95 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 15 min；94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)；最終72℃ 3 min。

PCR擴(kuò)增后，剩余的dNTP被去磷酸。反應(yīng)體系為：H2O 1.53 μl；SAP緩沖液0.17 μl；堿性磷酸酶(Sequenom)0.3 U。反應(yīng)條件：37℃ 40 min，85℃ 5 min。

單堿基延伸反應(yīng)體系為：H2O 0.755 μl；10×iPLEX緩沖液0.2 μl；終止混合物0.2 μl、iPLEX酶0.041 μl；延伸引物0.804 μl(10 μmol/L)。單堿基延伸反應(yīng)條件：94℃ 30 s；94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 3 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 13.0和SHEsis在線軟件[11]完成。對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行等位基因頻率、基因型頻率統(tǒng)計(jì)，并對(duì)EEA組和CG組進(jìn)行H-W平衡檢測。單個(gè)SNP在EEA組和CG組分布頻率的差異采用χ2檢驗(yàn)，通過Shesis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)計(jì)算同一基因不同位點(diǎn)間(DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn))的D'和r2，以測量對(duì)應(yīng)位點(diǎn)間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)緊密程度，并計(jì)算單體型頻率[12,13]。

2 結(jié)果

2.1 基因型和等位基因分布特征分析

DIO1基因的C785T位點(diǎn)、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)的基因型分型成功率在EEA組和CG組分別為100%和100%、99.2%和99.2%及99.2%和100%。

EEA組和CG組在上述多態(tài)位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率均符合H-W平衡(P>0.05)，表明本研究的各組研究對(duì)象均具有群體代表性。

DIO1基因的C785T位點(diǎn)、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率分別見表2、表3及表4。結(jié)果顯示，將EEA組和CG組按不同性別分組，在DIO1的C785T位點(diǎn)、DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)，各組間基因型和等位基因頻率均無顯著性差異(P>0.05)，表明在上述位點(diǎn)，基因型和等位基因的分布無性別差異。(此處在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮的是先比較不同性別組中的差異，如果有性別差異，則繼續(xù)比較不同性別各組間的差異，如果無性別差異，則僅用CG數(shù)據(jù)即表2中第一行127人的基因型與等位基因分布與EEA組的各組比較，以獲得普通人與不同運(yùn)動(dòng)等級(jí)、運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目長跑運(yùn)動(dòng)員間各多態(tài)位點(diǎn)的分布差異，也就是下一段文字的內(nèi)容)。

將EEA組按運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目和運(yùn)動(dòng)等級(jí)進(jìn)行分組并與CG組(127人總體)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DIO2基因的Gly3Asp位點(diǎn)，基因型在CG組與國際健將組(χ2=5.97，P=0.05)、CG組與馬拉松組(χ2= 8.45，P=0.01)間的分布均差異顯著，但各組間的等位基因分布頻率差異均不顯著。在DIO1基因的C785T位點(diǎn)及DIO2基因的Thr92Ala位點(diǎn)，各組間的基因型和等位基因頻率沒有顯著性差異(P>0.05，表2，表3，表4)。

Tab. 2 Distribution of genotype and allele frequencies of C785T polymorphism in DIO1 gene

Tab. 3 Distribution of genotype and allele frequencies of Thr92Ala polymorphism in DIO2 gene

Tab. 4 Distribution of genotype and allele frequencies of Gly3Asp polymorphism in DIO2 gene

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol group

2.2 連鎖不平衡和單體型分析

對(duì)DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)進(jìn)行D'和r2計(jì)算，結(jié)果顯示，兩個(gè)位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(D'=0.900，r2=0.133)，形成了4個(gè)單體型CC、CT、TC及TT(所有頻率小于 0.03 的基因型都被忽略)。其中將EEA組和CG組間按不同性別分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男CG組與女CG組及男CG組與男EEA組間，CT單體型的分布均差異顯著(χ2= 4.03，P=0.04及χ2=4.23，P=0.04，表5)。

Tab. 5 Distribution of haplotype frequencies of DIO2 gene in EEA and CG

*P<0.05vsmale control group

將不同性別運(yùn)動(dòng)員按運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目和運(yùn)動(dòng)等級(jí)進(jìn)行分組并與相應(yīng)性別的CG組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CT單體型在男CG組與男健將組、男CG組與男馬拉松組間的分布均有顯著性差異(χ2=4.96，P=0.03和χ2=6.52，P=0.01)，TC單體型則在女CG組與女國際健將組、女CG組與女5/10 km組間的分布差異顯著(χ2=4.98，P=0.03和χ2=3.82，P=0.05，表6)。

3 討論

不同人的血漿TH水平差異顯著，表明環(huán)境因素外，遺傳因素對(duì)TH功能調(diào)節(jié)也可能具有潛在影響[14]。雙生子研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素與血清中游離T4(free T4,FT4)和游離T3(free T3,FT3)約65%的變化量有關(guān)[15]；另一項(xiàng)關(guān)于墨西哥-美國人的研究則發(fā)現(xiàn)，個(gè)體間血清TH含量26%～64%的變化由遺傳決定[16]。

人DIO1基因位于染色體1p33-p32，長度約 17.5 kb，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，編碼250個(gè)氨基酸，分子量為28.7 kD。Peeters等于2003年發(fā)表了一項(xiàng)研究，報(bào)道了兩個(gè)影響健康人血清T3/rT3比率的DIO1多態(tài)位點(diǎn)C785T和A1814G[8]。研究發(fā)現(xiàn)，等位基因785T與較高的rT3水平和較低的T3/rT3比率有關(guān)，而1814G與較高的T3/rT3比率有關(guān)，故推測等位基因785T與1814G會(huì)分別導(dǎo)致DIO1活性的下降和上升。由于它們均位于mRNA的3’UTR，研究者推測這兩個(gè)突變改變了mRNA的穩(wěn)定性或折疊[8]。由于該折疊處于硒代半胱氨酸的插入序列中，而該序列可影響蛋白質(zhì)與硒代半胱氨酸殘基的結(jié)合，對(duì)該基因在編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)內(nèi)與其他多態(tài)基因的連鎖亦有顯著影響，故該折疊的改變可導(dǎo)致DIO1的活性發(fā)生變化[6]。

人DIO2基因位于染色體14q24.3，基因全長15 kb，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。Thr92Ala位點(diǎn)是首個(gè)被研究的DIO2多態(tài)位點(diǎn)[17]，雖然它并不影響血清中的T3水平，卻與三個(gè)不同人群中胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)，推測這可能是骨骼肌和/或脂肪中DIO2的活性降低的結(jié)果，即在對(duì)胰島素較敏感的組織，如脂肪組織和骨骼肌中，DIO2活性的下降會(huì)降低組織局部的T3活性，從而表現(xiàn)與胰島素抵抗間的關(guān)聯(lián)[9]。鑒于此推測，Peeters等研究分別轉(zhuǎn)染92Thr和92Ala的不同細(xì)胞的DIO2活性，結(jié)果不同細(xì)胞間未見差別[8]；而Canani等在研究中卻發(fā)現(xiàn)，DIO2的活性在表達(dá)92Ala等位基因的肌肉和甲狀腺勻漿混合物中較低[18]，進(jìn)而推測該位點(diǎn)的作用是它與其他多態(tài)位點(diǎn)間存在連鎖的結(jié)果。近期，研究發(fā)現(xiàn)DIO2的Gly3Asp多態(tài)位點(diǎn)與年輕人血清T3/T4比率呈現(xiàn)相關(guān)[19]，且與Thr92Ala位點(diǎn)分處于不同的單體型等位基因中[10]。

Tab. 6 Distribution of haplotype frequencies of DIO2 gene in EEA and CG of different genders

*P<0.05vsmale control group;#P<0.05vsfemale control group

本研究通過比較不同多態(tài)位點(diǎn)在普通漢族人與優(yōu)秀長跑運(yùn)動(dòng)員中的分布頻率差異，首次探討了DIO1和DIO2基因SNPs與有氧耐力之間可能的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DIO2基因的Gly3Asp位點(diǎn)，基因型在CG組與國際健將組、CG組與馬拉松組間的分布均差異顯著，其中TT基因型僅存在于EEA組，但等位基因的分布頻率在CG組與EEA組中差異不顯著。因TT基因型在EEA組頻率很低，國際健將組為5%，馬拉松組為3%，因此，該位點(diǎn)尚無法作為預(yù)測中國北方地區(qū)漢族人群杰出有氧耐力素質(zhì)的分子標(biāo)記，需要增加樣本量進(jìn)一步加以確認(rèn)。

對(duì)DIO2基因的Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析后發(fā)現(xiàn)，二者處于強(qiáng)連鎖不平衡，形成了4個(gè)單體型CC、CT、TC及TT。其中，將EEA組和CG組按不同性別分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男CG組與女CG組及男CG組與男EEA組間，CT單體型的分布均差異顯著，表明CT單體型的分布具有性別差異，且該單體型是男子優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員有氧耐力素質(zhì)的分子標(biāo)記。將不同性別運(yùn)動(dòng)員按運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目和運(yùn)動(dòng)等級(jí)進(jìn)行分組并與相應(yīng)性別的CG組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CT單體型在男CG組與男健將組、男CG組與男馬拉松組間的分布均有顯著性差異，TC單體型在女CG組與女國際健將組、女CG組與女5/10 km組間的分布差異顯著，表明CT單體型和TC單體型的分布分別在不同等級(jí)、不同項(xiàng)目的男、女運(yùn)動(dòng)員間差異顯著，可分別作為男子健將級(jí)運(yùn)動(dòng)員和馬拉松運(yùn)動(dòng)員以及女子國際健將運(yùn)動(dòng)員和5/10 km運(yùn)動(dòng)員有氧耐力素質(zhì)的分子標(biāo)記。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)中國北方漢族人群中DIO1基因C785T位點(diǎn)、DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)多態(tài)性存在種族差異。以上3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率與歐美人之間差異均非常顯著(P<0.01)：在歐美人群中，DIO1基因C785T位點(diǎn)的基因型分布頻率分別為CC(41%)、CT(46%)和TT(13%)[20]，本研究中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率則分別為CC(76%)、CT(20%)和TT(3%)；在荷蘭人中[20]，Thr92Ala位點(diǎn)的基因型頻率分別為CC(39%)、CT(47%)和TT(14%)，在丹麥人中基因型頻率分別為CC(41%)、CT(46%)和TT(12%)[8]，本研究中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率則分別為CC(17%)、CT(56%)和CT(27%)；在Gly3Asp位點(diǎn)，基因型頻率在荷蘭人中分別為CC(42.7%)、CT(44.4%)和TT(12.9%)[18]，本研究中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率則分別為CC(67%)、CT(23%)和TT(10%)，說明人種差異可能是本研究與國外的研究結(jié)果不盡相同的原因。因這種人種和地域上的差異可能是種族進(jìn)化、人類遷移及自然淘汰的結(jié)果，所以這種差異造成的基因多態(tài)分布特征不同可能形成不同的關(guān)聯(lián)結(jié)果。

綜上所述，DIO1基因C785T位點(diǎn)、DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)多態(tài)性單獨(dú)均與中國北方地區(qū)漢族人群杰出有氧運(yùn)動(dòng)素質(zhì)無關(guān)，但DIO2基因Thr92Ala及Gly3Asp位點(diǎn)單體型CT是男子優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員有氧耐力素質(zhì)的分子標(biāo)記，可用于男子長跑健將級(jí)運(yùn)動(dòng)員及馬拉松運(yùn)動(dòng)員的分子選材，TC單體型則是女子長跑國際健將運(yùn)動(dòng)員和5/10 km運(yùn)動(dòng)員有氧耐力素質(zhì)的分子標(biāo)記。