哌唑嗪(PRA)拮抗去甲腎上腺素(NE)誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞(hESCs-CMs)肥大

黃 潔 裴晏梓 劉 陽(yáng) 陳海燕 孫 寧△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心臟超聲診斷科 上海 200032)

心肌肥大是一種較常見的原發(fā)性心臟病,主要特點(diǎn)是心肌細(xì)胞體積增大及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加,這也是多種心血管類疾病共有的病理過(guò)程[1]。心肌肥大本質(zhì)上是一種代償性反應(yīng),往往源于心臟超負(fù)荷,臨床經(jīng)常表現(xiàn)為左室的異常肥大,室壁增厚,心室腔縮小,可能發(fā)展為進(jìn)行性心衰、致死性心律失常[2],甚至是心源性猝死[3-4]。

去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)作為一種刺激因子可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大[5],哌唑嗪(prazosin,PRA)對(duì)此具有一定的拮抗效果[6-7]。研究表明,NE可以通過(guò)心臟的腎上腺素能受體(adrenoceptor,AR)α和β[8],進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)PLC、PKC、MAPK等信號(hào)通路,進(jìn)而使得心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因(如細(xì)胞骨架蛋白基因myosin、actin、titin等)過(guò)度或異常表達(dá)[9-11]。

目前臨床上仍缺乏治療心肌肥大的特效藥物。β-AR是一種比較理想的藥物靶點(diǎn),但是關(guān)于α受體的研究相對(duì)缺乏。由于人類心肌細(xì)胞在體外無(wú)法擴(kuò)增,來(lái)源稀少,人類心臟疾病的體外細(xì)胞模型建立及大規(guī)模藥物篩選一直無(wú)法開展。隨著胚胎干細(xì)胞體外中胚層定向分化的技術(shù)成熟,可大量獲得人源性心肌細(xì)胞,這為人類心血管疾病的研究與藥物篩選提供了有力的工具[12-13]。本研究在人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)的基礎(chǔ)上大量獲取人源性心肌細(xì)胞(hESCs-cardiomyocytes,hESCs-CMs),進(jìn)一步探索α受體拮抗劑PRA對(duì)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響,為今后運(yùn)用hESCs-CMs進(jìn)行人類心肌肥大的建模及大規(guī)模藥物篩選提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

主要試劑與儀器 哌唑嗪鹽酸鹽(美國(guó)Sigma Aldrich公司),重酒石酸去甲腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司),DMEM/F12培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Corning公司),mTeSR培養(yǎng)基(加拿大STEMCELL公司)、FBS、0.25%無(wú)EDTA胰酶 (Trypsin)、B27添加劑、B27不含胰島素添加劑、鼠來(lái)源的肌鈣蛋白T(cardia troponin T,TNNT2)單克隆抗體,Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、Trizol(美國(guó)Thermo Fisher公司),兔來(lái)源的肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2v,MLC2v)多克隆抗體、PE熒光標(biāo)記的抗兔IgG二抗、細(xì)胞流式試劑盒、基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司),Ⅰ型膠原酶、IWR-1、DAPI(美國(guó)Sigma Aldrich公司),CHIR-99021(美國(guó)Selleckchem公司),防熒光淬滅封片劑(美國(guó)Vector公司),Triton-X100 (北京鼎國(guó)公司),山羊血清封閉工作液、4%多聚甲醛固定液(中國(guó)谷歌生物公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix (日本TOYOBO公司),熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司),實(shí)時(shí)定量PCR儀(瑞士Roche公司),12孔細(xì)胞培養(yǎng)板、激光共聚焦皿(無(wú)錫耐思生物科技有限公司),Leica顯微鏡FelixGX細(xì)胞動(dòng)緣檢測(cè)系統(tǒng),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

hESC系H7的培養(yǎng)及心肌的定向分化 將hESCs-H7用mTeSR培養(yǎng)液培養(yǎng)在6孔板中(包被有基質(zhì)膠),待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為75%～85%,將培養(yǎng)液替換為含有10 μmol/L CHIR99021的B27無(wú)胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,48 h后去除CHIR99021,替換為新的B27無(wú)胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,24 h后換成含有5 μmol/L IWR-1的B27無(wú)胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,48 h后去除IWR-1,替換為新的B27無(wú)胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,48 h后換為B27含胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,隔天換液,分化至8～10天可于顯微鏡下看見自主搏動(dòng)的心肌細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

心肌細(xì)胞分化效率的流式檢測(cè) 取分化至25天的心肌細(xì)胞,先用膠原酶Ⅰ于37 ℃消化30 min,DPBS洗去剩余的膠原酶Ⅰ后即加入0.25%不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化,盡量將心肌細(xì)胞消化為單細(xì)胞。367×g離心2 min,收集細(xì)胞沉淀,使用試劑盒內(nèi)固定液將收集的心肌細(xì)胞于4 ℃固定30 min,離心(同上)棄上清,使用1×BD洗滌緩沖液清洗細(xì)胞沉淀2次,再用洗滌緩沖液將細(xì)胞重懸,分為3組,即空白對(duì)照、二抗陰性對(duì)照(只加二抗1∶200稀釋)和正常實(shí)驗(yàn)組(先加一抗1∶100稀釋,后加二抗),每組細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/mL。一抗4 ℃孵育1 h,洗去后加入二抗,4 ℃避光孵育30 min,洗去后PBS重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)。

心肌細(xì)胞免疫熒光染色 取分化至25天的心肌細(xì)胞,盡量消化為單細(xì)胞,并接種在鋪有無(wú)菌玻片的12孔板中,使用10%FBS/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),接種24 h后加入相應(yīng)的藥物處理,培養(yǎng)5天,每2天換液1次,以保證心肌細(xì)胞完全鋪展開。接種的心肌細(xì)胞分為3組(每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔):對(duì)照組不含NE和Prazosin;NE組只加入20 μmol/L NE處理5天;PRA組,先加入15 μmol/L PRA 處理3 h,再加入20 μmol/L NE共同處理5天。將3組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后,染cTNT、熒光二抗及DAPI,使用熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝,計(jì)算每個(gè)視野的細(xì)胞個(gè)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有視野均隨機(jī)采集。利用imageJ軟件分析細(xì)胞大小形態(tài),首先測(cè)量采集圖像右下角標(biāo)尺的像素距離,并修改相應(yīng)的比例尺,使用不規(guī)則圖形工具圈出細(xì)胞輪廓進(jìn)行測(cè)量分析,同一條件下計(jì)算心肌細(xì)胞的相對(duì)面積并進(jìn)行比較。

qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因 心肌細(xì)胞消化后接種于鋪有基質(zhì)膠的12孔板中,分組同上,藥物處理5天后收集細(xì)胞,并用Trizol裂解細(xì)胞,提取mRNA,測(cè)定濃度,反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因,引物序列參見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 The primers sequence of qRT-PCR

心肌細(xì)胞收縮力檢測(cè) 心肌細(xì)胞消化為單細(xì)胞后接種于鋪有基質(zhì)膠的激光共聚焦皿中,分組同上,接種48 h后加入藥物再處理24 h,用FelixGX細(xì)胞動(dòng)緣檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定并分析心肌細(xì)胞的收縮功能及跳動(dòng)情況。

結(jié) 果

心肌細(xì)胞定向分化及分化效率檢測(cè) 按圖1A描述的步驟對(duì)hESCs-H7進(jìn)行中胚層定向誘導(dǎo)分化,成功得到hESCs-CMs。收集分化至30天的心肌細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè),檢測(cè)指標(biāo)為心室肌細(xì)胞所特有表達(dá)的蛋白—肌球蛋白輕鏈2(MLC2v),結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLC2v陽(yáng)性細(xì)胞可達(dá)到90 %以上(圖1B),說(shuō)明我們所建立的分化體系相對(duì)成熟,所分化出來(lái)的心肌細(xì)胞純度較高,絕大部分為心臟工作細(xì)胞——心室肌細(xì)胞。

PRA與NE對(duì)心肌細(xì)胞面積的影響 對(duì)分化25天的心肌細(xì)胞用藥物處理5天,進(jìn)行免疫熒光染色(圖2A),用image J軟件對(duì)細(xì)胞面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,NE組心肌細(xì)胞面積有明顯增大的趨勢(shì)(P<0.000 1);與NE組相比,PRA組心肌細(xì)胞面積減少(P<0.01),然而并未完全恢復(fù)到對(duì)照組水平,說(shuō)明PRA可以在一定程度上抑制NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增大(圖2B)。我們還統(tǒng)計(jì)了每個(gè)視野的細(xì)胞個(gè)數(shù),分析發(fā)現(xiàn)NE與PRA處理均未引起心肌細(xì)胞數(shù)目變化(圖2C)。

A:Schematic diagram of differentiation of hESCs to CMs.B:Representativeflow cytometry assay ofMLC2vexpression in CMs at D30 after differentiation.Over 90% cells wereMLC2vpositve CMs (n=5,93.76%±0.38%).Isotype control was used as a negative control to set the gating parameters.

圖1 hESCs-CMs定向分化與流式檢測(cè)
Fig 1 Differentiation and flow cytometry assay of hESCs-CMs

A:Representative immunofluorescence staining ofTNNT2 andDAPIat D30 after differentiation (scale bar:100 μm).CON:PBS;NE:20 μmol/L NE;PRA+NE:15 μmol/L PRA+20 μmol/L NE.B:Quantification of cell size by pixels (n>100);C:Quantification of cell numbers per field (n>30).(1)P<0.000 1;(2)P<0.01.

圖2 PRA處理前后hESCs-CMs的免疫熒光染色(×200)
Fig 2 Immunofluorescence staining of hESCs-CMs before and after PRA treatment (×200)

PRA與NE對(duì)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 利用qRT-PCR方法檢測(cè)PRA和NE處理5天后的心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化,我們發(fā)現(xiàn),NE處理組肥大相關(guān)的標(biāo)志B型鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)較對(duì)照組表達(dá)明顯增高(P<0.001),肌小節(jié)蛋白相關(guān)基因TNNT2、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2c,Mef2C)、肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum Ca+-ATPase 2a,Serca2a)及肌球蛋白重鏈7(myosin heavy cgain 7,MYH7)與MYH6比值表達(dá)均上升(P分別<0.01和<0.05);與NE處理組相比,加入PRA后,BNP和TNNT2表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),Serca2a和MYH7/MYH6比值有下降趨勢(shì)。這表明,PRA可以抑制NE誘導(dǎo)的hESCs-CMs肥大相關(guān)基因BNP、TNNT2表達(dá)的上調(diào)(圖3)。

Cardiac hypertrophic-related genes’ mRNA levels in hESCs-CMs were analyzed by qRT-PCR,and normalized toGAPDHexpression.CON:PBS;NE:20 μmol/L NE;PRA+NE:15 μmol/L PRA+20 μmol/L NE.(1)P<0.05;(2)P<0.01;(3)P<0.001.

圖3 PRA處理前后心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)
Fig 3 The expression of cardiac hypertrophy-associated genes before and after PRA treatment

PRA與NE對(duì)心肌細(xì)胞收縮力及跳動(dòng)頻率的影響 我們檢測(cè)了分化約30天的心肌細(xì)胞在藥物處理24 h后的細(xì)胞收縮情況,NE處理后可以產(chǎn)生類似正性肌力的作用,可明顯提高心肌細(xì)胞的收縮力及搏動(dòng)頻率(P<0.000 1);而PRA處理后,心肌細(xì)胞的收縮強(qiáng)度及跳動(dòng)頻率均有所減弱(P<0.000 1)。這表明PRA可以抑制NE引起的心肌細(xì)胞收縮力及跳動(dòng)頻率的增加(圖4)。

討 論

心肌肥大可分為生理性肥厚和病理性肥厚,生理性肥厚常常見于孕婦、運(yùn)動(dòng)員等[14-15],病理性肥大常常見于高血壓、心梗、先心病等[16]。目前心肌肥大已是公認(rèn)的導(dǎo)致猝死、心衰等心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一[17-18],然而臨床上尚無(wú)針對(duì)性治療的藥物,因此探明發(fā)生機(jī)制、尋找藥物靶點(diǎn)、開發(fā)特效藥物已成為心血管領(lǐng)域的重要研究方向。

引起心肌肥大的因素通常分為3類:(1)機(jī)械性因素,如壓力負(fù)荷過(guò)度、容積超負(fù)荷等[19];(2)神經(jīng)體液內(nèi)分泌性因素,如加壓素、血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素等[20-21];(3)遺傳性因素,如肌節(jié)蛋白突變引起的肥大型心肌病等[22]。NE是一種常用的刺激因子,能導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大,甚至是細(xì)胞的凋亡[23]。

在新生乳鼠的原代心肌細(xì)胞上,PRA可以抑制NE誘導(dǎo)的心肌肥大[24]。本研究中,通過(guò)體外二維分化培養(yǎng),我們將hESCs-H7成功誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞,獲得hESCs-CMs[25]。研究表明,hESCs-CMs無(wú)論是從基因表達(dá)的模式,還是細(xì)胞電生理、收縮功能等多個(gè)方面,都比鼠的心肌細(xì)胞更接近人類的心肌組織[26-28],而我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)行研究也更加接近于臨床患者心肌肥大的治療。我們發(fā)現(xiàn)NE可誘導(dǎo)hESCs-CMs肥大,進(jìn)一步肯定了NE促肥大的效果,具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞面積增加,肥大相關(guān)基因mRNA表達(dá)的上調(diào),心肌細(xì)胞收縮強(qiáng)度及跳動(dòng)頻率的增加,而α受體拮抗劑PRA能夠部分抑制細(xì)胞面積的增加,使肥大相關(guān)基因BNP、TNNT2表達(dá)下調(diào),收縮力及跳動(dòng)頻率降低,表明PRA能改善NE誘導(dǎo)的肥大效果。

A:Representative images showing the contraction force measuredby FelixGX detection system.B:Quantification of contractility in cardiomyocytes 24 h after PRA treatment (n>50).C:Quantification of beating frequency 24 h after PRA treatment.CON:PBS;NE:20 μmol/L NE;PRA+NE:15 μmol/L PRA+20 μmol/L NE.(1)P<0.000 1.

圖4 PRA處理前后單個(gè)hESC-CM收縮力及跳動(dòng)頻率檢測(cè)
Fig 4 The contractility and beating frequency detection of the single hESC-CM before and after PRA treatment

心肌細(xì)胞分布有α受體和β受體,研究表明這兩種受體均參與心肌肥大的過(guò)程[29-31]。在心肌組織中,β受體表達(dá)相對(duì)較多,包括β1和β2受體,這些受體表達(dá)在心肌細(xì)胞膜的表面,與心肌的收縮功能關(guān)系密切[32-33]。針對(duì)α受體,NE表現(xiàn)為強(qiáng)烈的興奮作用,而對(duì)β受體作用較弱,α受體的經(jīng)典拮抗劑PRA能夠抑制NE導(dǎo)致的收縮力增強(qiáng),表明心肌細(xì)胞的收縮功能在某種程度上也與α受體有關(guān)。

綜上所述,本研究表明PRA對(duì)hESCs-CMs可改善NE導(dǎo)致的心肌肥大,為運(yùn)用hESCs-CMs進(jìn)行人類心肌肥大建模及大規(guī)模藥物篩選提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。而PRA發(fā)揮作用的具體機(jī)制以及α受體能否作為臨床治療心肌肥大的有效藥物靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步的研究。