規(guī)?；i場豬源沙門氏菌的耐藥性及相關(guān)耐藥基因檢測

張 海，方 英，徐春志，景書灝，楊 峰，陳 紅，袁翠霞

（貴陽市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550081）

沙門氏菌（Salmonella）是腸桿菌科沙門氏菌屬的成員，是危害人類和畜禽健康的重要病原體之一，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生學(xué)上都有非常重要的意義。由于抗菌藥物長期、廣泛和不合理使用，使沙門氏菌的耐藥菌株和多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥性問題日益突出，同時也威脅到了人類的健康。為此筆者于2017年11月至2018年11月在貴陽富之源農(nóng)業(yè)科技有限公司對臨床上分離到的6株豬源沙門氏菌進(jìn)行抗菌藥物的藥敏試驗和相關(guān)耐藥基因檢測，并對抗菌藥物的耐藥性與相應(yīng)耐藥基因關(guān)系進(jìn)行分析，為臨床治療豬沙門氏菌病時合理用藥及沙門氏菌多重耐藥機(jī)制的進(jìn)一步研究提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

6株豬源沙門氏菌分離自貴州省某規(guī)?；B(yǎng)豬場送檢的病、死豬樣本，由貴陽市動物疫病預(yù)防控制中心分離、純化、鑒定、保存。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 DNA Marker、細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，MH瓊脂（Mueller-Hinton Agar）和MH肉湯購置青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥敏紙片與藥敏試驗

試驗所用的抗菌藥物包括β-內(nèi)酰胺類的頭孢克洛、青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢拉定，氨基糖苷類的卡那霉素、新霉素、丁胺卡那、鏈霉素、慶大霉素，氟喹諾酮類的氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、吡哌酸，共15種獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS2010年標(biāo)準(zhǔn)，作出結(jié)果判斷。

1.4 引物設(shè)計與合成

參照GenBank上已發(fā)布的9種畜禽病原菌的相關(guān)耐藥基因序列，運(yùn)用引物在線設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，分別用于擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX、SHV、TEM，氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS、qnrB，氨基糖苷類耐藥基因aacC4、addA1、aacC2。耐藥基因PCR擴(kuò)增的引物序列詳見表1。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取試驗菌株基因組DNA。

1.6 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

以提取的沙門氏菌基因組DNA為模板，建立20 μL PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，滅菌雙蒸水 7.0 μL。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物6.0 μL在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌分離株藥敏試驗結(jié)果

對分離出來的6株豬源沙門氏菌參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性試驗，試驗結(jié)果具體見表2。由表2結(jié)果顯示，分離出來的6株豬源沙門氏菌對青霉素、氨芐西林和吡哌酸高度耐藥，耐藥率為100.00%（6/6）；對其余抗菌藥物的耐藥率分別為：阿莫西林、環(huán)丙沙星耐藥率為83.33%（5/6），卡那霉素、諾氟沙星耐藥率為66.67%（4/6），頭孢拉定、新霉素、丁胺卡那和恩諾沙星的耐藥率為50.00%（3/6），氧氟沙星的耐藥率為33.33%（2/6），頭孢克洛、鏈霉素和慶大霉素的耐藥率為16.67%（1/6）。

表2 6株沙門氏菌分離株對15種抗菌藥物敏感性試驗

2.2 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

圖1為PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。由圖1可知，該規(guī)模化豬場6株豬源沙門菌分別擴(kuò)增出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、CTX和SHV的菌株比例分別為 50.00%（3/6）、50.00%（3/6）和33.33%（2/6）；擴(kuò)增出氨基糖苷類耐藥基因addA1、aacC2和aacC4的菌株比例分別為50.00%（3/6）、50.00%（3/6）和 50.00%（3/6）；擴(kuò)增出氟喹諾酮類耐藥基因qnrB和qnrS的菌株比例分別為50.00%（3/6）和 33.33%（2/6），未能檢測到耐藥基因qnrA。

圖1 耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們對畜禽類產(chǎn)品的需求也快速增長，同時大量的抗菌藥物被使用?？股氐膹V泛使用及濫用導(dǎo)致沙門氏菌及其它細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥情況也日益嚴(yán)重[1]，世界各地報道多重耐藥沙門氏菌的分離率也越來越高[2]。

本研究結(jié)果顯示，沙門氏菌分離株對青霉素、氨芐西林、吡哌酸、阿莫西林、環(huán)丙沙星、卡那霉素和諾氟沙星等抗生素的耐藥率較高，這與江萍等[3]研究人員報道的結(jié)果基本一致，提示臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎用藥。頭孢拉定、新霉素、丁胺卡那、恩諾沙星和氧氟沙星，在臨床上可選擇性使用。頭孢克洛、鏈霉素和慶大霉素的耐藥率為在20%以下，在臨床上可以繼續(xù)使用。在多重耐藥方面，對7種以上抗生素耐藥的菌株達(dá)到66.67%，這與潘志明等[4]的報道一致。在臨床上應(yīng)該合理用藥，采用多種藥物交替使用等用藥方式以降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的幾率。

對分離到的豬源沙門氏菌進(jìn)行耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶耐藥基因的現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍，本研究所檢測的6株臨床分離的沙門氏菌中，TEM、SHV、ddA1、aacC2、aacC4、qnrB 和 qnrS 均有較高的檢出率，這與藥物敏感試驗的結(jié)果和目前臨床用藥的情況是基本上一致[5]。β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類的各3種耐藥基因均檢出，而氟喹諾酮3種耐藥基因只檢測出qnrB和qnrS，未能檢測到耐藥基因qnrA。當(dāng)然，即使檢測出了分離菌株所攜帶的耐藥基因也不一定對該類藥物高度耐藥，藥敏試驗中度敏感的菌株也可能擴(kuò)增出相應(yīng)的耐藥基因[6]，可能是因為該耐藥基因在表達(dá)過程中受到某種因素抑制而不出現(xiàn)耐藥表型，或者是由于其它因素的影響而使該基因暫時、長久散失或功能減弱，也可能是因為該基因表達(dá)的條件還未成熟，處于沉默基因[7]。耐藥基因的檢測有助于了解該規(guī)模化養(yǎng)豬場沙門氏菌流行株耐藥基因存在的種類、數(shù)量及流行規(guī)律，從而豐富和完善豬源致病性沙門氏菌耐藥性的分子流行病學(xué)資料。通過對規(guī)模化養(yǎng)豬場臨床分離到的豬源沙門氏菌的藥敏試驗和耐藥基因的檢測，能夠更好地指導(dǎo)臨床用藥，以降低細(xì)菌的耐藥性。