手性藥物的檢測方法研究進展

(南京大學金陵學院， 南京 210089)

1 前言

手性藥物即在藥物分子結構中引入手性中心所得到的一對互為鏡像與實物的對映異構體。目前，臨床上使用的藥物約有三分之一是手性藥物。在藥代動力學方面，手性藥物也可能在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄中表現(xiàn)出一定程度的立體選擇性。因此手性藥物的檢測在新藥研發(fā)、活性化合物篩選和藥物檢驗中均十分重要。本文就手性藥物的檢測方法進行綜述。

2 手性藥物的檢測方法

近年來各種檢測新方法不斷應用于手性藥物的分析中，包括旋光法(polarimetry)和旋光色散法(optical rotation dispersion method, ORD)、圓二色性法(電子圓二色性法electron circular dichroism, ECD、振動圓二色性法vibration circular dichroism, VCD)、手性拉曼光譜法(Raman optical activity, ROA)、質譜法(mass spectrum, MS)、核磁共振法(nuclear magnetic resonance, NMR)，電化學法(Electrochemical)、光學傳感器等。

2.1 旋光法和旋光色散法

旋光法(polarimetry)一直是人們最常用來檢測手性分子的方法，以其操作簡單、檢測價格低而極受歡迎，也是現(xiàn)在《中國藥典》中廣泛使用的方法。雖然影響因素較多，包括溫度、檢測光波長、樣本雜質等，但其在一定條件下滿足手性分析基本需求。在實驗中通常以光學純度來對樣品進行分析。通常將供試品在鈉光譜D線處的旋光度與相同條件下同種純品旋光度的比值定義為光學純度(optical purity, O.P)，其值某種意義上反映了供試品純度。戴月華等人[1]用旋光法測定硫酸西索米星氯化鈉注射液中西索米星的含量。郝玲花等人[2]用旋光度法測定布洛芬注射液中精氨酸的含量，主藥布洛芬不干擾精氨酸測定。楊振林等人[3]用旋光法測定氯霉素滴耳液中氯霉素的含量。董杰[4]用旋光法測定鹽酸地爾硫卓原料及片劑中鹽酸地爾硫卓的含量。

旋光色散法(ORD)則可從多個波長更全面的角度對供試分子進行分析，在分子絕對構型的判斷和醫(yī)學診斷上發(fā)揮重要作用。而如何改進儀器，從而快速準確的得到旋光度成為研究的焦點，這將推動旋光色散儀的發(fā)展。Jiang Shixin等[5]提出使用CCD來測量旋光度，這使得旋光色散法的檢測時間大大縮短、準確度大大提高并且為旋光色散儀的改進提供新的思路。

2.2 圓二色性法

圓二色性(circular dichroism, CD)早在19世紀就被發(fā)現(xiàn)，但由于其信號響應絕對強度過小等原因導致其實驗儀器在20世紀50、60年代才出現(xiàn)。而對于圓二色性信號的放大的問題尚未完全解決。

2.2.1電子圓二色性

手性分子的圓二色性最初在紫外波段被發(fā)現(xiàn)，因分子對紫外吸收主要反映出分子電子能級躍遷的情況，故稱為電子圓二色性法(ECD)，而現(xiàn)在圓二色性多指在紫外-可見波段出現(xiàn)的圓二色現(xiàn)象。圓二色性法較旋光法更為靈敏、準確、可靠，受到外界影響較小。在圓二色性法中，對映體純度常用對映體過剩率(ee)表示：ee=(CR-CS)/(CR+CS)，CR和CS分別為R和S體濃度。經(jīng)理論與實驗證明，圓二色性法可測得樣本ee值，并與手性色譜拆分的結果相似。圓二色性法可在不進行手性拆分的條件下進行對映體純度分析，較傳統(tǒng)的色譜而言更加簡便、快速。Macduff O. Okuom等[6]在不借助高效液相色譜的條件下利用圓二色性法對手性藥物的純度分析，對布洛芬、雅維等藥物的測得效果較好，并認為其將成為一種綠色的手性藥物測定方法。由于電子圓二色性法(ECD)反映了電子的性質，因此也廣泛的用于分子絕對構型的預測[7]。張林群等人[8]分別用圓二色光譜儀和旋光儀對右旋葡萄糖和左旋硫酸奎寧進行比旋度檢測。研究表明，無論是右旋還是左旋化合物，兩種方法測定的結果相近，相對誤差小于5%。但用圓二色光譜儀檢測的線性范圍要比旋光儀法寬10倍，檢出限低一個數(shù)量級，穩(wěn)定性更好。他們進一步對原料藥哌拉西林鈉和他唑巴坦用圓二色光譜儀法進行比旋度的檢測，結果均與中國藥典吻合。但用圓二色光譜法不僅樣品用量少，而且能獲得200～600nm范圍內(nèi)樣品旋光度的變化趨勢，從而能對樣品的旋光性進行全面研究，并且能進行單波長、多波長和連續(xù)波長的旋光檢測。圓二色光譜法操作便捷、準確、靈敏，有較好的實用性。

2.2.2振動圓二色性法

振動圓二色性法(VCD)指物質對左右圓偏振紅外光吸光度的差值，是振動光活性(Vibration optical activity, VOA)中較早得以運用的技術[9]。紅外脈沖發(fā)射器的使用與改進使得振動圓二色性法的檢測時間降至皮秒、飛秒，甚至可檢測出蛋白質等分子在溶液中的結構變化，被認為是解析香料、金屬配合物、生物大分子等手性分子結構最常使用的方法[10，11]。振動圓二色性法主要用于分子絕對構型的測定，而Quesada-Moreno MM等人[12]首次利用振動圓二色性法用于定量分析，測出樟腦的ee值，這將為振動圓二色性法用于藥物含量測定提供了新的用途。雖然現(xiàn)在單獨利用振動圓二色性法可預測結構，但往往出現(xiàn)錯誤，故在解析分子絕對構型時應結合多種方法，綜合后給出答案[13]。

2.3 手性拉曼光譜

手性拉曼光譜法(ROA)指物質在拉曼散射截面上對左右圓偏振光散射強度差值。手性拉曼光譜法較振動圓二色性法運用晚，激光光源的使用解決了信號強度過弱的問題。 Simmen Benjamin等人[14]通過氘原子、氟原子、甲基的衍生化實驗推斷出手性拉曼光譜法可識別2433個手性中心，而后有人提出手性拉曼光譜法的強度信號較位移信號更重要的想法，并提出了相應的算法[9]，為使用手性拉曼光譜法解析、預測結構提供了新的啟示。由于其可定性、定量的進行手性分析并且樣本可回收等特點，故手性拉曼光譜法多用于體內(nèi)活性分子的分析，例如Belen Nieto-Ortega等[15]利用手性拉曼光譜法測定體內(nèi)抗血管生成素類分子，為新藥開發(fā)等方面提供啟示。賈國卿等人[16]以葡萄糖酸內(nèi)酯的堿性水解為模型反應，利用手性拉曼光譜，從分子振動的角度討論了葡萄糖酸內(nèi)酯水解前后的手性變化行為。趙彥牧等人[17]從旋光拉曼 (Raman optical activity, ROA) 譜的峰強, 求取了手性分子反-2, 3-環(huán)氧丁烷的旋光拉曼鍵極化率。由分子手性中心的 C-H 產(chǎn)生的偶極矩與拉曼激發(fā)過程中，電荷流動產(chǎn)生的躍遷磁偶極矩的耦合，來理解旋光拉曼活性產(chǎn)生的機理。王鵬等人[18]利用自主搭建的457nm短波長手性拉曼光譜儀對三磷酸腺苷(ATP)在酸性(pH=2.0)和中性(pH=7.0)水溶液中的手性結構進行了研究。通過拉曼和手性拉曼光譜圖的分析，發(fā)現(xiàn)在不同的pH條件下，拉曼光譜表現(xiàn)出了明顯的差異，但在相應的手性拉曼光譜圖中，光譜輪廓具有極大相似性，主要的差別反應在950～1150cm-1光譜區(qū)域，說明pH值的改變，主要影響了環(huán)外磷酸基團和呋喃糖環(huán)之間的相互作用方式。

2.4 質譜法

質譜法(MS)被認為只能提供分子質量與官能團的信息，而手性藥物具有相同的分子質量，相似的結構，而無法通過MS區(qū)分[19，20]。而隨著新技術的成熟與發(fā)展，使得MS的靈敏度和特異性大大提高，并且軟電離源的使用使得動力學方法分析手性藥物成為可能，并在對映體間制造差異的條件更為多樣[21]。常用的方法包括兩類，一類為將MS連接在有手性分離能力的裝置之后成為一個高靈敏的檢測系統(tǒng)，比如在手性色譜后連接MS[22，23]；另一類為直接利用MS直接進行手性識別。后者具有快速、靈敏度高、專屬性強等優(yōu)點，且不需要復雜的前處理或衍生化，不受檢測試劑或溶劑的干擾，并具有潛在的高通量檢測能力[24]。

本文主要介紹利用質譜直接進行手性識別。按其原理可分為四類，分別為：(1)非對映異構體配合物解離法，指根據(jù)對映體與手性選擇試劑結合后復合物穩(wěn)定性不同而實現(xiàn)手性分析；(2)手性離子遷移質譜，對映物與手性選擇試劑結合后電遷移性質出現(xiàn)差異而得以區(qū)分；(3)主客體法，指根據(jù)對映體與手性選擇試劑的親和力不同導致結合物的相對豐度不同而進行分析；(4)客體交換離子/分子反應法，指根據(jù)對映體與手性選擇試劑結合存在動力學差異而進行手性分析。本文主要介紹較常用的非對映異構體配合物解離法與手性離子遷移法。

2.4.1非對映異構體配合物解離法

非對映異構體配合物解離法(collision-induced dissociation of diastereomeric complex)是針對手性分子和手性配體形成的非對映異構體配合物，以串聯(lián)質譜的碰撞誘導裂解為基礎而建立的方法。通常采用二價過渡金屬離子與手性識別試劑物及分析物形成三元四配位配合物離子并通過碰撞誘導解離使其裂解，由于對映體之間的空間構型不同，配合物離子中結合的牢固程度也不同，導致在質譜圖上裂解產(chǎn)物的離子豐度不同，據(jù)此可對樣品的手性進行識別。根據(jù)對映體復合物自由能變的差值可判斷其手性識別的能力。而動力學方法的手性選擇性和手性識別能力與分析物和手性試劑的相對濃度無關、易于定量分析、對雜質的高度耐受性無需提純、無需使用同位素標記試劑、更容易制成商業(yè)儀器等諸多優(yōu)點而廣泛使用，但其手性選擇性仍然需要提高。Wu Lianming等人[25]利用動力學質譜對一種含硼抗生素進行定量分析。耿穎等人[26]使用電噴霧質譜技術，研究3種氨基酸(D-賴氨酸、L-谷氨酰胺和 L-酪氨酸)作為手性選擇探針對格列美脲和格列美脲異構體的識別效應，首次實現(xiàn)了格列美脲和格列美脲順式異構體的質譜法快速識別。戴田行等人[27]采用質譜技術，利用手性探針酰氯對鹽酸蘭地洛爾及其3個立體異構體進行了區(qū)分識別研究，采用兩個手性酰氯探針 N-對甲苯磺?；?L-苯丙氨酰氯(TSPC)和(-)-莰烷酰氯與鹽酸蘭地洛爾反應產(chǎn)生共價結合產(chǎn)物，放大了鹽酸蘭地洛爾與其立體異構體的結構差異。吳若菲等人[28]利用電噴霧電離質譜(ESI-MS)研究了18-冠醚-6和20種天然氨基酸之間的非共價相互作用。結果表明，18-冠醚-6與氨基酸能形成化學計量比為1∶1的非共價復合物。冠醚主要通過與氨基酸上的NH2配位而與其結合，故在L型氨基酸中，側鏈為烷基(或氫原子)的氨基酸、堿性氨基酸對冠醚的親和性更強。同時，實驗也表明冠醚僅能識別部分中性氨基酸及其異構體。Marta Cal等人[29]使用一系列β-氨基異羥肟酸和組氨酸異羥肟酸的衍生物，通過MS/MS實驗證實了所研究的超分子體系在氣相中的高穩(wěn)定性。還研究化合物的碎裂途徑，得到的結果表明三元12-金屬催化-4的形成過程不是選擇性的，各種結構和手性的配體可以結合到這些系統(tǒng)中。

2.4.2手性離子遷移質譜

手性離子遷移質譜(ion mobility mass spectrometry)是一種氣相分析方法，基于被檢測離子的大小與形狀[30]。離子遷移質譜儀和普通質譜儀相類似，相比之下多了離子遷移池，其本身也不具有手性識別功能，但由于手性分子與檢測試劑形成配合物，而配合物的結構差異導致其在離子遷移池電場下的碰撞截面和運動行為產(chǎn)生差異，從而區(qū)分異構體[31]。主要采用三種離子遷移技術：時間離子遷移譜、行波離子遷移譜和場不對稱離子遷移譜。阿替洛爾、絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、糖類、葡萄糖、青霉胺、纈草酚、苯丙氨酸和色氨酸等均可通過離子遷移質譜從他們的消旋體中分離檢測[32]。在特布他林對映體的檢測實驗中，與高效液相色譜和毛細管色譜相比，場不對稱離子遷移質譜檢測限更低(可達0.1%)、樣品分析時間更短[33]。手性離子遷移質譜具有識別多個手心中心的能力，較普通的色譜法更加靈敏、快速，并具有一定的定量分析能力，在手性分析方面有一定的發(fā)展?jié)撃堋?/p>

2.5 核磁共振法

由于對映體的結構十分相似，故互為對映體的兩種化合物的信號難以直接通過核磁共振譜區(qū)分，但對映體處于不對稱環(huán)境中，形成非對映異構關系時可能產(chǎn)生化學位移的不等價，從而使相應基團的信號分開。

核磁共振法(NMR)技術分析對映體純度主要通過兩種方法來實現(xiàn)：(1)使用手性試劑與對映體反應，使之轉化為一對非對映體并比較非對映異構體的信號，即衍生化法；(2)在對映體混合物中加入手性溶劑或者手性位移試劑，提供一個外部非對映環(huán)境。這兩種方法均利用非對映體相應基團的信號產(chǎn)生不同的化學位移，使信號分開。并通過信號強度可求出其ee值。現(xiàn)在利用NMR測定ee的方法主要有三種：手性衍生化試劑法、手性溶劑化試劑法、手性位移試劑法。由于手性位移試劑法造價較高，不易回收等缺點難以大規(guī)模使用，故此處不做敘述。

2.5.1手性衍生化試劑法

手性衍生化法(chiral derivation)是一種簡單高效的方法，一次可分析多個手心中心[34]。首先通過衍生化試劑將樣品轉化為相應的非對映體，然后利用核磁共振信號的不同加以分析。最常用的手性衍生化試劑為MTPA和Mosher試劑。 Kelly AM等人[35]報道了一種通過多組分反應來測定手性胺對映體純度的方法，較為準確，時間較少。Sabot等人[36]報道了一種通過多組分反應來測定手性胺ee值的試劑CDA-1，其與胺類化合物反應，衍生化條件溫和、不需要分離純化可直接進行19FNMR。Tickell D.A[37]報道了一種簡單實用的三組分手性衍生化方法，用1HNMR波譜分析測定手性羥胺的對映性，包括用2-甲酰苯基硼酸和消旋的聯(lián)二萘酚處理，得到非對映體硝基-硼酸酯混合物并用1HNMR直接進行分析可準確反映母體羥胺純度。

2.5.2手性溶劑化試劑法

手性溶劑化試劑(chiral NMR solvent)通過非共價相互作用與所研究的手性化合物相結合，而其識別手性結構的原理可能是在溶液中，手性溶劑與底物的配合物可能具有不同的化學位移，而由于對映體與溶劑中組分的結合力不同導致他們的溶劑環(huán)境不同也可引起不同的化學位移[38]。Thomas P.Quinn 等人[39]報道了一種新的氮雜冠醚，用來測試手性扁桃酸系列衍生物的ee值，位移值最大達到0.13×10-6，誤差在1%以內(nèi)。Redondo等[40]采用 NMR 對平喘藥物孟魯司特進行了手性分析，并考察了 9 種不同的手性溶劑的分離效果，即D-二苯甲?；剖帷-二甲苯甲?；剖?、(+)-樟腦酸、S-聯(lián)萘酚、S-3,3′-二苯基-2,2′- 聯(lián)萘-1,1′-二醇、R-3,3′-二-9-蒽基甲氧基-1,1′-聯(lián)-2-萘酚、R-3,3′-二-9-菲基-1,1′-聯(lián)-2-萘酚、Pirkle醇和(-)-辛可尼丁。實驗結果發(fā)現(xiàn)，大部分溶劑都能使孟魯司特形成非對映異構體，可檢測R-型異構體中S-型雜質的含量；就 NMR 手性識別能力和實驗條件的簡易性而言，(-) -辛可尼丁作為手性溶劑較為合適。

2.6 電化學法

電化學傳感器具有儀器微型化、操作方便快速、在線、實時、低成本、靈敏度高、環(huán)保等優(yōu)點。將手性識別與電化學方法結合形成的手性電化學傳感器通過不同的電化學技術(例如循環(huán)伏安法(CV)、差分脈沖伏安法(DPV)、電化學交流阻抗技術(EIS)等)研究手性選擇劑與目標手性分子間相互作用后電化學信號的差異[41]。電化學手性傳感器的基礎是構建導電性良好的手性界面，識別不同手性物質時，需選擇適當?shù)氖中宰R別材料，常用的手性識別材料有蛋白質、DNA、氨基酸及其衍生物、人工高分子聚合物、手性超分子化合物以及手性金屬配合物[42]。由于電化學手性傳感器具有快速、靈敏、操作簡單的優(yōu)點，基于碳納米材料的手性電化學傳感器引起了廣泛的關注，常見的有石墨烯，碳納米管，石墨烯量子點等[43 ]。

馬驕等人[44]選擇β-環(huán)糊精(β-CD)作為手性選擇劑，將其滴涂到經(jīng)金鉑納米合金與還原氧化石墨烯復合材料(Au-PtNPs/rGO)修飾的玻碳電極表面，得到 β-CD/Au-PtNPs/rGO 修飾電極，采用差分脈沖伏安法(DPV)研究該修飾電極與酪氨酸對映體(D-或L-Tyr)的相互作用。實驗結果表明，修飾電極可分別與D-或L-Tyr作用，并呈現(xiàn)不同的電流響應，其中與 L-Tyr 作用后的峰電流值明顯高于 D-Tyr。張亞會等人[45]采用滴涂方式將羧酸化多壁碳納米管(f-MWCNTs)修飾于玻碳電極(GCE)表面成膜，然后恒電位法在上述修飾電極表面電沉積殼聚糖(CS)膜，形成CS和f-MWCNTs復合膜修飾電極(CS/f-MWCNTs/GCE)，并用于色氨酸(Trp)對映異構體的手性識別。張金萍等人[46]設計合成了一種石墨烯/殼聚糖復合物薄膜，并將其作為電化學電極應用于選擇性檢測具有旋光活性的色氨酸(Trp)對映體。軒春芝等人[47]將牛血清白蛋白(BSA)自組裝在經(jīng)電沉積納米金修飾的玻碳電極表面，構建了簡單的電化學手性傳感界面，并討論了該界面與不同濃度范圍的抗瘧疾手性藥物奎寧和奎尼丁的相互作用。采用差分脈沖伏安法(DPV)和紫外-可見分光光度法(UV-Vis)測試了 BSA 與奎寧、奎尼丁之間的選擇性作用。陳翠等人[48]將氯鉑酸與 L-纈氨酸按一定比例混合，通過循環(huán)伏安法在玻碳電極表面電沉積形成鉑摻雜L-纈氨酸聚合膜，“一步”構建一個簡單的手性傳感平臺，以普萘洛爾自身為氧化還原探針，采用差分脈沖伏安法研究了該手性傳感平臺與普萘洛爾對映異構體之間的相互作用。

3 展望

隨著科技的進步，對手性藥物分析提出了更高的要求。隨著物理學、材料學及相關技術的發(fā)展，利用手性傳感器對藥物進行手性分析成為可能。將可通過傳感器直接獲得供試物手性信號，并進行手性分析。與傳統(tǒng)的手性純度檢測方法相比，手性傳感器可簡單、高效、實時檢測混合物中對映體的相對含量。此外，納米結構光學傳感器是一個重要的發(fā)展方向之一[49]。段鵬飛及其合作者創(chuàng)新性地改進了圓偏振發(fā)光的測試方法，實現(xiàn)了各種不透明、非均相和薄膜體系的圓偏振發(fā)光測試，提出并驗證了“上轉換圓偏振發(fā)光”這一新的概念，實現(xiàn)了上轉換圓偏振發(fā)光的測試；同時研究了手性超分子體系中手性信息和激發(fā)態(tài)能量轉移遷移，以及激發(fā)態(tài)能量與手性信息的交互，發(fā)現(xiàn)手性組裝體系中能量轉移可以增強發(fā)光不對稱因子glum這一重要規(guī)律[50-54]。這些成果一方面拓展了圓偏振發(fā)光的測試方法，另一方面也拓寬了圓偏振發(fā)光在超分子化學研究領域的應用。尤其為具有上轉換發(fā)光性質的手性材料的研究提供了有效的表征手段，可用來研究手性信息和激發(fā)態(tài)能量的轉移傳遞規(guī)律，為分析化學、光化學與物理、材料化學、手性科學等研究提供新的研究思路。將圓偏振發(fā)光與上轉換發(fā)光的概念交叉結合，新的發(fā)光現(xiàn)象和新檢測手段為生物光學成像提供新的方法和途徑，為開展圓偏振發(fā)光應用提供新的思路。